| 摘要 | 第1-6页 |
| Abstract | 第6-11页 |
| 1.前言 | 第11-19页 |
| ·细胞色素P450 | 第11-13页 |
| ·细胞色素P450概述 | 第11-12页 |
| ·细胞色素P450的结构特征 | 第12页 |
| ·细胞色素P450与药物代谢 | 第12-13页 |
| ·CYP51研究进展 | 第13-17页 |
| ·概述 | 第13-14页 |
| ·基因凋节 | 第14-15页 |
| ·CYP51结构分析及其与功能的关系 | 第15-17页 |
| ·结构解析 | 第15-16页 |
| ·定点突变研究 | 第16-17页 |
| ·CYP51 抑制剂研究概况 | 第17-19页 |
| ·抑菌机制 | 第17-18页 |
| ·真菌对CYP51抑制剂的抗性 | 第18-19页 |
| 2.材料与方法 | 第19-27页 |
| ·实验材料 | 第19-20页 |
| ·菌株和质粒 | 第19页 |
| ·化学试剂及抗生素 | 第19页 |
| ·工具酶与其它试剂 | 第19页 |
| ·培养基及常用缓冲液 | 第19-20页 |
| ·Ni-NTA亲和层析柱 | 第20页 |
| ·实验方法 | 第20-27页 |
| ·玉米黑粉菌CYP51的生物信息学分析预测 | 第20页 |
| ·玉米黑粉菌CYP51基因的扩增 | 第20-21页 |
| ·特异性引物的设计 | 第20页 |
| ·基因的PCR扩增 | 第20-21页 |
| ·DNA限制性内切酶反应 | 第21页 |
| ·DNA片断的回收和连接 | 第21页 |
| ·碱裂解法小量提取质粒DNA | 第21页 |
| ·大肠杆菌感受态细胞的制备和转化 | 第21页 |
| ·阳性克隆的筛选及重组质粒的鉴定 | 第21页 |
| ·重组蛋白的原核表达及表达产物的SDS-PAGE分析 | 第21-22页 |
| ·蛋白的定量及重组蛋白中CYP51含量测定 | 第22页 |
| ·重组蛋白同杀菌剂结合光谱的测定 | 第22-23页 |
| ·Ni-NTA亲和层析柱分离纯化蛋白质 | 第23页 |
| ·重组目的蛋白的大量表达 | 第23页 |
| ·重组蛋白的分离纯化 | 第23页 |
| ·酿酒酵母感受态细胞的制备和转化 | 第23-24页 |
| ·菌落PCR鉴定重组酿酒酵母重组子 | 第24页 |
| ·玉米黑粉菌CYP51基因的真核表达 | 第24-25页 |
| ·玉米黑粉菌CYP51突变体的构建 | 第25-26页 |
| ·突变体引物的设计 | 第25页 |
| ·诱导突变基因 | 第25页 |
| ·突变质粒选择 | 第25-26页 |
| ·突变质粒转化 | 第26页 |
| ·突变体原核表达 | 第26-27页 |
| ·突变体原核表达分析 | 第26页 |
| ·突变体同杀菌剂结合能力分析 | 第26-27页 |
| 3.结果与分析 | 第27-53页 |
| ·玉米黑粉菌CYP51的生物信息学分析预测 | 第27-28页 |
| ·CYP51跨膜结构分析 | 第27-28页 |
| ·CYP51同源模建的构建 | 第28页 |
| ·玉米黑粉菌CYP51基因的克隆和鉴定 | 第28-29页 |
| ·玉米黑粉菌CYP51基因的表达及同杀菌剂结合光谱的测定 | 第29-42页 |
| ·全长玉米黑粉菌CYP51基因的原核表达及表达条件的优化 | 第29-30页 |
| ·去除N端跨膜残基的玉米黑粉菌CYP51基因的原核表达 | 第30-34页 |
| ·玉米黑粉菌CYP51基因的原核表达 | 第34-36页 |
| ·玉米黑粉菌CYP51表达条件的优化 | 第36-37页 |
| ·重组玉米黑粉菌CYP51蛋白(YHCYP51)含量测定 | 第37-38页 |
| ·YHCYP51重组蛋白和同杀菌剂结合光谱的测定 | 第38-42页 |
| ·YHCYP51重组蛋白同商品化杀菌剂的结合光谱 | 第38-41页 |
| ·YHCYP51重组蛋白同XF及ZST系列合成杀菌剂的结合光谱 | 第41-42页 |
| ·YHCYP51重组蛋白的分离纯化 | 第42-43页 |
| ·玉米黑粉菌CYP51基因的酵母表达 | 第43-44页 |
| ·玉米黑粉菌CYP51基因真核表达质粒的构建 | 第43页 |
| ·含有CYP51的酿酒酵母重组子鉴定 | 第43-44页 |
| ·CYP51基因在酿酒酵母中的表达 | 第44页 |
| ·玉米黑粉菌CYP51突变体构建及表达分析 | 第44-53页 |
| ·玉米黑粉菌CYP51突变体的构建 | 第44-47页 |
| ·突变蛋白在E.coli中的表达水平的比较 | 第47-48页 |
| ·突变体蛋白同杀菌剂结合能力的比较 | 第48-53页 |
| 4.讨论 | 第53-56页 |
| 参考文献 | 第56-60页 |
| 硕士期间发表的论文 | 第60页 |
| 衷心感谢以下基金资助 | 第60-61页 |
| 致谢 | 第61页 |
