| 摘要 | 第1-6页 |
| Abstract | 第6-8页 |
| 目录 | 第8-12页 |
| 1. 引言 | 第12-27页 |
| ·番木瓜环斑病毒概述 | 第13-16页 |
| ·症状表现 | 第13页 |
| ·PRSV株系、寄主范围和传播途径 | 第13-14页 |
| ·马铃薯Y病毒属基因组结构和功能研究 | 第14页 |
| ·番木瓜抗PRSV基因工程研究 | 第14-16页 |
| ·真核翻译起始因子4E的结构、功能和调节 | 第16-17页 |
| ·真核翻译起始因子4E的结构 | 第16页 |
| ·真核翻译起始因子4E的功能 | 第16页 |
| ·真核翻译起始因子4E的调节 | 第16-17页 |
| ·植物真核翻译起始因子4E的研究进展 | 第17-22页 |
| ·真核翻译起始因子4E与蛋白质翻译起始 | 第17-18页 |
| ·eIF4E参与马铃薯Y病毒繁殖的可能机制 | 第18-19页 |
| ·马铃薯Y病毒可选择性地利用eIF4E基因家族的成员 | 第19-20页 |
| ·植物eIF4E与病毒互作的研究 | 第20页 |
| ·eIF4E在植物抗病上的研究 | 第20-22页 |
| ·本文研究蛋白质相互作用的方法 | 第22-24页 |
| ·细胞核酵母双杂交 | 第22-23页 |
| ·双分子荧光互补技术 | 第23-24页 |
| ·本研究的目的意义和技术路线 | 第24-27页 |
| ·目的意义 | 第24-26页 |
| ·技术路线 | 第26-27页 |
| 2 材料与方法 | 第27-51页 |
| ·材料与试剂 | 第27-33页 |
| ·植物材料 | 第27页 |
| ·主要的酶和生化试剂 | 第27页 |
| ·菌株和质粒 | 第27-28页 |
| ·表达载体及克隆载体图 | 第28-30页 |
| ·培养基 | 第30-33页 |
| ·主要仪器设备 | 第33页 |
| ·番木瓜eIF4E和eIFiso4E基因的克隆 | 第33-39页 |
| ·番木瓜RNA提取 | 第33-34页 |
| ·试验器材的处理 | 第33-34页 |
| ·从组织中提取总RNA | 第34页 |
| ·双链cDNA合成 | 第34-35页 |
| ·引物设计和RT-PCR反应 | 第35-36页 |
| ·PCR扩增程序 | 第36页 |
| ·PCR产物回收与鉴定 | 第36-39页 |
| ·PCR产物回收 | 第36-37页 |
| ·PCR回收产物与克隆载体pMD18-T Vector的连接 | 第37页 |
| ·大肠杆菌感受态细胞的制备(氯化钙法) | 第37-38页 |
| ·连接产物转化感受态细胞 | 第38页 |
| ·重组质粒的菌液PCR鉴定 | 第38页 |
| ·序列鉴定与分析 | 第38-39页 |
| ·酵母双杂交鉴定PRSV-VPg与番木瓜eIF4E和eIFiso4E的互作 | 第39-47页 |
| ·酵母诱饵表达载体pBD-GAL4 Cam-VPg的构建及鉴定 | 第39-41页 |
| ·VPg基因加入相应的酶切位点 | 第39页 |
| ·重组质粒的提取(采用TIANGEN小提中量试剂盒) | 第39-40页 |
| ·重组质粒的酶切鉴定 | 第40页 |
| ·诱饵载体pBD-GAL4 Cam的制备 | 第40页 |
| ·VPg基因与诱饵载体pBD-GALA-Cam的连接 | 第40-41页 |
| ·连接产物的转化及鉴定 | 第41页 |
| ·酵母激活域表达载体pAD-GAL4-2.1-eIF4E/eIFiso4E的构建及鉴定 | 第41-42页 |
| ·番木瓜eIF4E和eIFiso4E基因加入相应的酶切位点 | 第41-42页 |
| ·重组质粒的提取 | 第42页 |
| ·重组质粒的酶切鉴定 | 第42页 |
| ·激活域载体pAD-GAL4-2.1的制备 | 第42页 |
| ·番木瓜eIF4E和eIFiso4E基因与激活域载体pAD-GAL4-Cam的连接 | 第42页 |
| ·连接产物的转化及鉴定 | 第42页 |
| ·诱饵质粒的转化及毒性与自激活检测 | 第42-44页 |
| ·酵母菌株表型鉴定及酵母感受态细胞的制备 | 第43页 |
| ·酵母菌株表型鉴定 | 第43页 |
| ·酵母感受态细胞的制备 | 第43页 |
| ·分别转化重组子pBD-GAL4 Cam-VPg和空载体pBD-GAL4 Cam(对照)入酵母YRG-2感受态 | 第43-44页 |
| ·诱饵表达质粒的毒性检测 | 第44页 |
| ·诱饵质粒表达的融合蛋白自激活检测 | 第44页 |
| ·激活域载体转化酵母YRG-2及毒性与自激活检测 | 第44-45页 |
| ·酵母感受态细胞的制备 | 第44-45页 |
| ·分别转化重组子pAD-GAL4-2.1-eIF4E/eIFiso4E、空载体pAD-GAL4-2.1(阴性对照)及pGAL4(阳性对照)入酵母YRG-2感受态 | 第45页 |
| ·激活域表达质粒的毒性检测 | 第45页 |
| ·激活域表达质粒自激活检测 | 第45页 |
| ·酵母双杂交 | 第45-46页 |
| ·含有诱饵质粒的酵母感受态细胞的制备 | 第45页 |
| ·转化激活域重组子入含有诱饵质粒的酵母感受态细胞 | 第45-46页 |
| ·酵母克隆的初步鉴定 | 第46-47页 |
| ·β-半乳糖苷酶影印法筛选阳性克隆 | 第46页 |
| ·阳性酵母质粒的提取、回转大肠杆菌验证 | 第46-47页 |
| ·阳性克隆的测序 | 第47页 |
| ·双分子荧光互补技术验证鉴定PRSV-VPg与番木瓜eIF4E和eIFiso4E的互作 | 第47-51页 |
| ·BiFc载体的构建 | 第47-50页 |
| ·添加酶切位点 | 第47-48页 |
| ·酶切反应体系 | 第48-49页 |
| ·BiFc表达载体的构建与鉴定 | 第49-50页 |
| ·重组质粒的大量提取(利用TIANGEN的高纯度大提试剂盒) | 第50页 |
| ·基因枪转化 | 第50-51页 |
| ·金粉的处理 | 第50页 |
| ·基因枪子弹制备 | 第50-51页 |
| ·轰击 | 第51页 |
| ·洋葱表皮预处理 | 第51页 |
| ·荧光显微镜下观察 | 第51页 |
| 3 结果与分析 | 第51-64页 |
| ·番木瓜eIF4E和eIFiso4E基因的克隆 | 第51-56页 |
| ·番木瓜果实总RNA的提取 | 第51-52页 |
| ·番木瓜eIF4E基因全长序列的克隆 | 第52-53页 |
| ·番木瓜eIFiso4E基因全长序列的克隆 | 第53页 |
| ·Cp-eIF4E和Cp-eIFiso4E结构分析 | 第53-56页 |
| ·酵母双杂交互作结果 | 第56-60页 |
| ·酵母表达载体的构建 | 第56-58页 |
| ·酶切位点引入PRSV-VPg、Cp-eIF4E及Cp-eIFiso4E | 第56-57页 |
| ·诱饵载体和激活域载体的构建和鉴定 | 第57-58页 |
| ·酵母菌株YRG-2表型鉴定 | 第58页 |
| ·诱饵载体转化酵母YRG-2毒性及自激活检测 | 第58页 |
| ·激活域载体转化酵母YRG-2毒性及自激活检测 | 第58-59页 |
| ·酵母双杂交筛选结果 | 第59-60页 |
| ·营养缺陷型筛选及LacZ活性筛选 | 第59-60页 |
| ·回转验证及测序 | 第60页 |
| ·双分子荧光互补技术验证PRSV-VPg与Cp-EIF4E和Cp-eIFiso4E的互作结果 | 第60-64页 |
| ·BiFc载体的构建与鉴定 | 第60-62页 |
| ·基因枪转化结果 | 第62-64页 |
| 4 讨论 | 第64-67页 |
| ·Cp-eIF4E和Cp-eIFiso4E上与mRNA帽子及4G作用的活性部位氨基酸与其它eIF4E和eIFiso4E的高度保守 | 第64页 |
| ·已知抗病位点在Cp-eIF4E和Cp-eIFiso4E上的定位 | 第64-65页 |
| ·马铃薯Y病毒VPg利用植物eIF4E及eIFiso4E的情况 | 第65页 |
| ·GAL4酵母双杂交系统和BIFC同时研究PRSV-VPg与CP-eIF4E和CP-eIFiso4E的互作情况 | 第65-66页 |
| ·以番木瓜eIF4E为靶点抗PRSV的可行性 | 第66-67页 |
| 5 主要结论及进一步研究建议 | 第67页 |
| ·主要结论 | 第67页 |
| ·进一步研究建议 | 第67页 |
| 参考文献 | 第67-75页 |
| 附录 | 第75-76页 |
| 致谢 | 第76页 |
