| 摘要 | 第4-6页 |
| Abstract | 第6-7页 |
| 1 前言 | 第12-22页 |
| 1.1 天然橡胶产业的现状 | 第12-13页 |
| 1.1.1 提高橡胶树天然橡胶产量是保障我国对天然橡胶战略需求的需要 | 第12页 |
| 1.1.2 提高橡胶树单产是降低我国天然橡胶对外依存度的唯一途径 | 第12-13页 |
| 1.1.3 抗逆高产品种贫乏和乙烯利刺激采胶的负面效应是限制我国橡胶树高产稳产的两个产业技术瓶颈 | 第13页 |
| 1.1.4 研究橡胶树产胶和排胶的生化与分子调控机制,将为突破提高橡胶树单产的产业技术瓶颈提供理论基础 | 第13页 |
| 1.2 橡胶树抗寒品种选育种的选育 | 第13-15页 |
| 1.3 抗寒性早期鉴定技术研发 | 第15-17页 |
| 1.3.1 巴西橡胶树抗寒的生理机制的选择 | 第15-16页 |
| 1.3.2 巴西橡胶树抗寒的分子机制研究进展 | 第16-17页 |
| 1.4 抗寒机制的研究 | 第17-19页 |
| 1.4.1 植物抗寒机制研究的一个重大进展是发现茉莉酸和乙烯信号途径与调节植物抗寒有关,在CBF/DREB1介导的抗寒调控级联的上游发挥重要的作用 | 第17-18页 |
| 1.4.2 橡胶树抗寒机制的研究很不深入,大多停留在低温胁迫对抗冻物质含量的影响及其与膜系统稳定性关系方面 | 第18页 |
| 1.4.3 研究橡胶树抗寒机制对于研发抗寒能力早期选择技术具有重要的指导意义 | 第18-19页 |
| 1.5 热激转录因子(HSF)和热激蛋白(HSP) | 第19-21页 |
| 1.6 本研究的目的意义 | 第21-22页 |
| 2 材料与方法 | 第22-52页 |
| 2.1 试验时间与地点 | 第22页 |
| 2.2 热垦501和93-114抗寒性验证 | 第22页 |
| 2.3 橡胶树HbICE1基因低温胁迫响应的试验方法 | 第22-38页 |
| 2.3.1 试验处理 | 第22页 |
| 2.3.2 菌株载体 | 第22页 |
| 2.3.3 酶和生化试剂 | 第22页 |
| 2.3.4 RNA的提取 | 第22-23页 |
| 2.3.5 cDNA第一链的合成 | 第23页 |
| 2.3.6 阅读框(ORF)的获得 | 第23-24页 |
| 2.3.7 PCR产物的回收 | 第24页 |
| 2.3.8 3'-RACE扩增 | 第24-26页 |
| 2.3.9 q-PCR | 第26-27页 |
| 2.3.10 HbICE1亚细胞定位 | 第27-30页 |
| 2.3.11 HbICE1酵母表达试验 | 第30-34页 |
| 2.3.12 检测重组酵母对非生物胁迫的抗性 | 第34-38页 |
| 2.4 比较转录组样品的处理试验方法 | 第38-40页 |
| 2.4.1 试验处理 | 第38-39页 |
| 2.4.2 RNA提取与文库构建 | 第39页 |
| 2.4.3 测序、unigenes从头组装和功能注释 | 第39页 |
| 2.4.4 基因差异表达的生物信息学分析 | 第39-40页 |
| 2.5 橡胶树生理生化指标的测定 | 第40-42页 |
| 2.5.1 植物材料的处理 | 第40页 |
| 2.5.2 生理指标的测定方法 | 第40-42页 |
| 2.6 橡胶树HbHsp70-1基因低温胁迫响应的试验方法 | 第42-51页 |
| 2.6.1 菌株载体 | 第42页 |
| 2.6.2 酶和生化试剂 | 第42页 |
| 2.6.3 RNA的提取 | 第42页 |
| 2.6.4 cDNA第一链的合成 | 第42-43页 |
| 2.6.5 阅读框(ORF)的获得 | 第43-44页 |
| 2.6.6 PCR产物的回收 | 第44页 |
| 2.6.7 3'-RACE扩增 | 第44-46页 |
| 2.6.8 q-PCR | 第46页 |
| 2.6.9 原核表达载体HbHsp70-1的构建 | 第46-47页 |
| 2.6.10 双酶切及鉴定 | 第47页 |
| 2.6.11 目的片段的克隆和重组子的鉴定 | 第47-48页 |
| 2.6.12 转化 | 第48页 |
| 2.6.13 重组子菌种的测序和保存 | 第48-49页 |
| 2.6.14 质粒提取 | 第49页 |
| 2.6.15 重组子转化 | 第49页 |
| 2.6.16 重组后pGEX- HbHsp70-1的诱导表达 | 第49-50页 |
| 2.6.17 SDS-PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳) | 第50页 |
| 2.6.18 热激蛋白pGEX- HbHsp70-1的纯化 | 第50-51页 |
| 2.6.19 Western-Blot检测pGEX- HbHsp70-1诱导表达 | 第51页 |
| 2.6.20 pGEX- HbHsp70-1分子伴侣活性测定 | 第51页 |
| 2.6.21 pGEX- HbHsp70-1对温度的胁迫响应 | 第51页 |
| 2.7 数据分析 | 第51-52页 |
| 3 结果与分析 | 第52-104页 |
| 3.1 低温胁迫实验系统的建立 | 第52-57页 |
| 3.2 低温胁迫下橡胶树生理的变化 | 第57-63页 |
| 3.2.1 低温胁迫下抗寒无性系93-114内源过氧化氢脉冲式的产生 | 第57页 |
| 3.2.2 低温胁迫下抗寒无性系93-114中抗坏血酸(VC)和谷胱甘肽(GSH)明显增加 | 第57-58页 |
| 3.2.3 低温胁迫下抗寒无性系93-114和不抗寒无性系热垦501的SOD、POD和CAT活性 | 第58-59页 |
| 3.2.4 低温胁迫引起了渗透调节物质的积累 | 第59-60页 |
| 3.2.5 低温胁迫导致抗寒无性系93-114和不抗寒无性系热垦501丙二醛(MDA)含量不同程度的增加 | 第60-61页 |
| 3.2.6 低温胁迫导致热垦501和93-114叶绿素含量减少 | 第61-62页 |
| 3.2.7 低温胁迫下抗寒无性系93-114和不抗寒无性系热垦501叶片含水量 | 第62-63页 |
| 3.3 橡胶树无性系热垦501和93-114在低温胁迫条件下比较转录组分析 | 第63-88页 |
| 3.3.1 橡胶树转录组数据统计 | 第63-66页 |
| 3.3.2 功能注释与分类 | 第66-69页 |
| 3.3.3 差异表达基因分析 | 第69-72页 |
| 3.3.4 差异表达基因的GO功能分析 | 第72-75页 |
| 3.3.5 差异表达基因的MapMan and KEGG分析 | 第75-84页 |
| 3.3.6 低温胁迫下的差异表达转录因子(TFs) | 第84页 |
| 3.3.7 荧光定量PCR验证 | 第84-87页 |
| 3.3.8 实时荧光定量PCR | 第87-88页 |
| 3.4 低温胁迫响应基因HbICE1的研究 | 第88-95页 |
| 3.4.1 ICE基因的克隆 | 第88页 |
| 3.4.2 HbICE1生物信息学分析 | 第88-92页 |
| 3.4.3 HbICE1亚细胞定位 | 第92页 |
| 3.4.4 HbICE1在酵母中的转录激活实验 | 第92-93页 |
| 3.4.5 HbICE1基因在低温胁迫下的表达 | 第93-94页 |
| 3.4.6 低温胁迫下HbICE1基因在酵母中的表达 | 第94-95页 |
| 3.5 橡胶树HbHsp70-1基因低温胁迫响应的研究 | 第95-104页 |
| 3.5.1 HbHsp70-1基因的克隆 | 第95页 |
| 3.5.2 HbHsp70-1生物信息学分析 | 第95-99页 |
| 3.5.3 HbHsp70-1在E.coli中的表达和纯化 | 第99-101页 |
| 3.5.4 HbHsp70-1分子伴侣功能 | 第101页 |
| 3.5.5 HbHsp70-1对温度的胁迫响应 | 第101-104页 |
| 4 讨论 | 第104-113页 |
| 4.1 建立的橡胶树抗寒性评价实验系统对于筛选橡胶树抗寒种质和研究橡胶树抗寒机制具有重要意义 | 第104页 |
| 4.2 抗氧化系统的激活与橡胶树抗寒性的关系 | 第104-105页 |
| 4.3 在低温胁迫条件下,生长与胁迫相关基因的差异表达与橡胶树抗寒性的关系 | 第105-108页 |
| 4.4 HbICE1与HbHsp70-1的差异表达与抗寒性的关系 | 第108-113页 |
| 5 结论 | 第113-114页 |
| 6 创新之处 | 第114-115页 |
| 7 后续研究 | 第115-116页 |
| 参考文献 | 第116-126页 |
| 附件 | 第126-131页 |
| 附录 | 第131-163页 |
| 1 橡胶树抗寒无性系93-114、合口311、南华1和不抗寒无性系热垦501、PB86、PB5/51表达模式 | 第131-135页 |
| 2 HbHSP14994的功能验证 | 第135-163页 |
| 博士在读期间发表的论文 | 第163-164页 |
| 致谢 | 第164页 |
