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米曲霉脂肪酶基因在毕赤酵母中的高效表达与应用

摘要第4-6页
ABSTRACT第6-8页
符号说明第13-14页
第一章 绪论第14-24页
    1.1.脂肪酶的概述第14-15页
        1.1.1 脂肪酶简介第14页
        1.1.2 脂肪酶结构和催化反应机理第14页
        1.1.3 脂肪酶在手性药物中的应用第14-15页
    1.2 米曲霉及其脂肪酶第15-16页
        1.2.1 米曲霉的简介第15页
        1.2.2 米曲霉脂肪酶的研究进展第15-16页
    1.3 毕赤酵母表达系统第16-21页
        1.3.1 菌株和表型第17-18页
        1.3.2 启动子和载体第18-19页
        1.3.3 外源基因的整合第19页
        1.3.4 影响外源蛋白表达的主要因素第19-20页
        1.3.5 高密度发酵第20-21页
    1.4 本研究的意义与内容第21-24页
第二章 毕赤酵母重组表达菌株的构建和转化子的筛选第24-40页
    2.1 前言第24页
    2.2 实验材料第24-27页
        2.2.1 菌株和质粒第24页
        2.2.2 培养基与缓冲液第24-26页
        2.2.3 试剂与材料第26页
        2.2.4 主要器材第26-27页
    2.3 实验方法第27-36页
        2.3.1 aol基因的获得第27页
        2.3.2 引物设计与合成第27页
        2.3.3 工程菌X-33/ɑA-aol的构建第27-32页
        2.3.4 X-33/ɑA-aol阳性重组子的筛选第32-34页
        2.3.5 AOL重组脂肪酶的验证第34-36页
    2.4 结果与讨论第36-38页
        2.4.1 ɑA-aol重组菌的构建第36页
        2.4.2 X-33/ɑA-aol重组菌的构建第36-37页
        2.4.3 58#重组工程菌的发酵产物初步鉴定第37-38页
        2.4.4 表达产物的SDS-PAGE验证第38页
    2.5 小结第38-40页
第三章 毕赤酵母重组工程菌培养条件的研究第40-50页
    3.1 前言第40页
    3.2 实验材料第40-42页
        3.2.1 菌株和质粒第40页
        3.2.2 培养基第40-41页
        3.2.3 试剂与材料第41页
        3.2.4 仪器与设备第41-42页
    3.3 实验方法第42-44页
        3.3.1 菌株活化方法第42页
        3.3.2 种子培养方法第42页
        3.3.3 细胞密度测定方法第42页
        3.3.4 脂肪酶活力测定方法第42页
        3.3.5 蛋白含量测定方法第42页
        3.3.6 SDS-PAGE分析第42-43页
        3.3.7 发酵培养方法第43页
        3.3.8 重组脂肪酶的摇瓶表达条件的优化第43-44页
        3.3.9 5L发酵罐放大培养第44页
        3.3.10 生物量测定方法第44页
    3.4 结果与讨论第44-49页
        3.4.1 AOL表达条件的优化第44-47页
        3.4.2 5L发酵罐放大培养第47-49页
    3.5 小结第49-50页
第四章 重组AOL的分离纯化及酶学性质研究第50-60页
    4.1 前言第50页
    4.2 实验材料第50-52页
        4.2.1 菌株第50页
        4.2.2 培养基与缓冲液第50页
        4.2.3 试剂与材料第50-51页
        4.2.4 仪器与设备第51-52页
    4.3 实验方法第52-54页
        4.3.1 发酵液的预处理第52页
        4.3.2 阴离子交换柱层析第52页
        4.3.3 疏水作用层析第52-53页
        4.3.4 蛋白含量测定方法第53页
        4.3.5 酶活测定方法第53页
        4.3.6 SDS-PAGE分析第53页
        4.3.7 AOL酶学性质研究第53-54页
    4.4 结果与讨论第54-58页
        4.4.1 AOL的分离与纯化第54-55页
        4.4.2 AOL的纯度鉴定与分子量测定第55-56页
        4.4.3 AOL的酶学性质研究第56-58页
    4.5 小结第58-60页
第五章 脂肪酶AOL的固定化及其在R,S苯氧丙酸甲酯手性拆分中的应用第60-78页
    5.1 前言第60页
    5.2 实验材料第60-61页
        5.2.1 菌株第60页
        5.2.2 培养基与缓冲液第60页
        5.2.3 试剂与材料第60-61页
        5.2.4 仪器与设备第61页
    5.3 实验方法第61-66页
        5.3.1 预处理第61-62页
        5.3.2 酶活力测定第62页
        5.3.3 共价结合法制备固定化酶第62页
        5.3.4 脂肪酶固定化条件的优化第62-63页
        5.3.5 固定化脂肪酶性质研究第63页
        5.3.6 R,S-苯氧丙酸甲酯的酶法拆分第63-65页
        5.3.7 影响酶催化拆分条件的优化第65-66页
    5.4 结果与讨论第66-75页
        5.4.1 固定化脂肪酶制备条件的探究第66-69页
        5.4.2 固定化脂肪酶的酶学性质研究第69-71页
        5.4.3 固定化酶对苯氧丙酸甲酯的拆分第71-75页
    5.5 小结第75-78页
第六章 总结和展望第78-80页
    6.1 总结第78-79页
    6.2 展望第79-80页
参考文献第80-86页
附录1第86-88页
致谢第88-90页
攻读硕士学位期间取得的学术成果第90页

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