| 摘要 | 第4-6页 |
| ABSTRACT | 第6-8页 |
| 符号说明 | 第13-14页 |
| 第一章 绪论 | 第14-24页 |
| 1.1.脂肪酶的概述 | 第14-15页 |
| 1.1.1 脂肪酶简介 | 第14页 |
| 1.1.2 脂肪酶结构和催化反应机理 | 第14页 |
| 1.1.3 脂肪酶在手性药物中的应用 | 第14-15页 |
| 1.2 米曲霉及其脂肪酶 | 第15-16页 |
| 1.2.1 米曲霉的简介 | 第15页 |
| 1.2.2 米曲霉脂肪酶的研究进展 | 第15-16页 |
| 1.3 毕赤酵母表达系统 | 第16-21页 |
| 1.3.1 菌株和表型 | 第17-18页 |
| 1.3.2 启动子和载体 | 第18-19页 |
| 1.3.3 外源基因的整合 | 第19页 |
| 1.3.4 影响外源蛋白表达的主要因素 | 第19-20页 |
| 1.3.5 高密度发酵 | 第20-21页 |
| 1.4 本研究的意义与内容 | 第21-24页 |
| 第二章 毕赤酵母重组表达菌株的构建和转化子的筛选 | 第24-40页 |
| 2.1 前言 | 第24页 |
| 2.2 实验材料 | 第24-27页 |
| 2.2.1 菌株和质粒 | 第24页 |
| 2.2.2 培养基与缓冲液 | 第24-26页 |
| 2.2.3 试剂与材料 | 第26页 |
| 2.2.4 主要器材 | 第26-27页 |
| 2.3 实验方法 | 第27-36页 |
| 2.3.1 aol基因的获得 | 第27页 |
| 2.3.2 引物设计与合成 | 第27页 |
| 2.3.3 工程菌X-33/ɑA-aol的构建 | 第27-32页 |
| 2.3.4 X-33/ɑA-aol阳性重组子的筛选 | 第32-34页 |
| 2.3.5 AOL重组脂肪酶的验证 | 第34-36页 |
| 2.4 结果与讨论 | 第36-38页 |
| 2.4.1 ɑA-aol重组菌的构建 | 第36页 |
| 2.4.2 X-33/ɑA-aol重组菌的构建 | 第36-37页 |
| 2.4.3 58#重组工程菌的发酵产物初步鉴定 | 第37-38页 |
| 2.4.4 表达产物的SDS-PAGE验证 | 第38页 |
| 2.5 小结 | 第38-40页 |
| 第三章 毕赤酵母重组工程菌培养条件的研究 | 第40-50页 |
| 3.1 前言 | 第40页 |
| 3.2 实验材料 | 第40-42页 |
| 3.2.1 菌株和质粒 | 第40页 |
| 3.2.2 培养基 | 第40-41页 |
| 3.2.3 试剂与材料 | 第41页 |
| 3.2.4 仪器与设备 | 第41-42页 |
| 3.3 实验方法 | 第42-44页 |
| 3.3.1 菌株活化方法 | 第42页 |
| 3.3.2 种子培养方法 | 第42页 |
| 3.3.3 细胞密度测定方法 | 第42页 |
| 3.3.4 脂肪酶活力测定方法 | 第42页 |
| 3.3.5 蛋白含量测定方法 | 第42页 |
| 3.3.6 SDS-PAGE分析 | 第42-43页 |
| 3.3.7 发酵培养方法 | 第43页 |
| 3.3.8 重组脂肪酶的摇瓶表达条件的优化 | 第43-44页 |
| 3.3.9 5L发酵罐放大培养 | 第44页 |
| 3.3.10 生物量测定方法 | 第44页 |
| 3.4 结果与讨论 | 第44-49页 |
| 3.4.1 AOL表达条件的优化 | 第44-47页 |
| 3.4.2 5L发酵罐放大培养 | 第47-49页 |
| 3.5 小结 | 第49-50页 |
| 第四章 重组AOL的分离纯化及酶学性质研究 | 第50-60页 |
| 4.1 前言 | 第50页 |
| 4.2 实验材料 | 第50-52页 |
| 4.2.1 菌株 | 第50页 |
| 4.2.2 培养基与缓冲液 | 第50页 |
| 4.2.3 试剂与材料 | 第50-51页 |
| 4.2.4 仪器与设备 | 第51-52页 |
| 4.3 实验方法 | 第52-54页 |
| 4.3.1 发酵液的预处理 | 第52页 |
| 4.3.2 阴离子交换柱层析 | 第52页 |
| 4.3.3 疏水作用层析 | 第52-53页 |
| 4.3.4 蛋白含量测定方法 | 第53页 |
| 4.3.5 酶活测定方法 | 第53页 |
| 4.3.6 SDS-PAGE分析 | 第53页 |
| 4.3.7 AOL酶学性质研究 | 第53-54页 |
| 4.4 结果与讨论 | 第54-58页 |
| 4.4.1 AOL的分离与纯化 | 第54-55页 |
| 4.4.2 AOL的纯度鉴定与分子量测定 | 第55-56页 |
| 4.4.3 AOL的酶学性质研究 | 第56-58页 |
| 4.5 小结 | 第58-60页 |
| 第五章 脂肪酶AOL的固定化及其在R,S苯氧丙酸甲酯手性拆分中的应用 | 第60-78页 |
| 5.1 前言 | 第60页 |
| 5.2 实验材料 | 第60-61页 |
| 5.2.1 菌株 | 第60页 |
| 5.2.2 培养基与缓冲液 | 第60页 |
| 5.2.3 试剂与材料 | 第60-61页 |
| 5.2.4 仪器与设备 | 第61页 |
| 5.3 实验方法 | 第61-66页 |
| 5.3.1 预处理 | 第61-62页 |
| 5.3.2 酶活力测定 | 第62页 |
| 5.3.3 共价结合法制备固定化酶 | 第62页 |
| 5.3.4 脂肪酶固定化条件的优化 | 第62-63页 |
| 5.3.5 固定化脂肪酶性质研究 | 第63页 |
| 5.3.6 R,S-苯氧丙酸甲酯的酶法拆分 | 第63-65页 |
| 5.3.7 影响酶催化拆分条件的优化 | 第65-66页 |
| 5.4 结果与讨论 | 第66-75页 |
| 5.4.1 固定化脂肪酶制备条件的探究 | 第66-69页 |
| 5.4.2 固定化脂肪酶的酶学性质研究 | 第69-71页 |
| 5.4.3 固定化酶对苯氧丙酸甲酯的拆分 | 第71-75页 |
| 5.5 小结 | 第75-78页 |
| 第六章 总结和展望 | 第78-80页 |
| 6.1 总结 | 第78-79页 |
| 6.2 展望 | 第79-80页 |
| 参考文献 | 第80-86页 |
| 附录1 | 第86-88页 |
| 致谢 | 第88-90页 |
| 攻读硕士学位期间取得的学术成果 | 第90页 |