| 摘要 | 第4-6页 |
| ABSTRACT | 第6-8页 |
| 第一章 前言 | 第14-26页 |
| 1.1 木聚糖 | 第14-15页 |
| 1.2 低聚木糖 | 第15-16页 |
| 1.3 木聚糖酶 | 第16-21页 |
| 1.3.1 木聚糖酶的定义 | 第16页 |
| 1.3.2 木聚糖酶的类别 | 第16-17页 |
| 1.3.3 木聚糖酶的催化机制 | 第17-18页 |
| 1.3.4 木聚糖酶的空间结构 | 第18-19页 |
| 1.3.4.1 GH 10家族木聚糖酶三维结构 | 第18-19页 |
| 1.3.4.2 GH 11家族木聚糖酶三维结构 | 第19页 |
| 1.3.5 木聚糖酶的应用 | 第19-21页 |
| 1.3.5.1 造纸工业 | 第19-20页 |
| 1.3.5.2 生物燃料工业 | 第20页 |
| 1.3.5.3 食品和饲料行业 | 第20页 |
| 1.3.5.4 木聚糖酶工业应用的限制 | 第20-21页 |
| 1.4 木聚糖酶热稳定性的研究 | 第21-23页 |
| 1.4.1 盐桥 | 第21页 |
| 1.4.2 二硫键 | 第21-22页 |
| 1.4.3 疏水作用 | 第22页 |
| 1.4.4 氢键 | 第22-23页 |
| 1.4.5 某些特殊氨基酸 | 第23页 |
| 1.5 木聚糖酶热稳定性的分子改造 | 第23-25页 |
| 1.5.1 定向进化 | 第24页 |
| 1.5.2 理性设计 | 第24-25页 |
| 1.6 课题研究的意义及目标 | 第25-26页 |
| 第二章 材料与方法 | 第26-43页 |
| 2.1 材料 | 第26-29页 |
| 2.1.1 质粒与菌株 | 第26-27页 |
| 2.1.2 常用培养基与试剂的配制 | 第27-29页 |
| 2.1.4 主要网站和软件 | 第29页 |
| 2.2 实验方法 | 第29-43页 |
| 2.2.1 木聚糖酶Umxyn1OA的密码子优化 | 第29-30页 |
| 2.2.2 突变位点的选择 | 第30-31页 |
| 2.2.3 Umxyn1OA基因和突变酶基因的扩增 | 第31-33页 |
| 2.2.3.1 Umxyn1OA基因的扩增 | 第31页 |
| 2.2.3.2 突变酶基因的扩增 | 第31-33页 |
| 2.2.4 重组质粒的构建 | 第33-36页 |
| 2.2.4.1 双酶切目的基因和质粒pET30a | 第33-34页 |
| 2.2.4.2 目的基因与载体pET30a连接 | 第34-35页 |
| 2.2.4.3 重组质粒的Trans-T1转化 | 第35页 |
| 2.2.4.4 重组子的鉴定及筛选 | 第35-36页 |
| 2.2.4.5 重组质粒的提取及测序 | 第36页 |
| 2.2.5 重组木聚糖酶基因的诱导表达 | 第36-37页 |
| 2.2.5.1 大肠杆菌Transetta(DE3)化学转化 | 第36-37页 |
| 2.2.5.2 重组大肠杆菌的诱导表达 | 第37页 |
| 2.2.6 重组表达产物的鉴定和分析 | 第37-41页 |
| 2.2.6.1 SDS-PAGE蛋白电泳 | 第37-38页 |
| 2.2.6.2 重组蛋白的镍柱纯化 | 第38页 |
| 2.2.6.3 木聚糖酶酶活的测定 | 第38-39页 |
| 2.2.6.4 蛋白浓度标准曲线的制备 | 第39-41页 |
| 2.2.7 重组蛋白酶学性质的测定 | 第41-43页 |
| 2.2.7.1 最适反应pH的测定 | 第41页 |
| 2.2.7.2 最适反应温度的测定 | 第41页 |
| 2.2.7.3 pH耐受性 | 第41页 |
| 2.2.7.4 热稳定性 | 第41页 |
| 2.2.7.5 金属离子、表面活性剂、螯合剂对酶活力的影响 | 第41-42页 |
| 2.2.7.6 底物特异性的测定 | 第42页 |
| 2.2.7.7 动力学参数测定 | 第42页 |
| 2.2.7.8 木聚糖酶对低聚木糖的水解 | 第42-43页 |
| 第三章 结果与讨论 | 第43-76页 |
| 3.1 野生型基因Umxyn10A在大肠杆菌中的重组表达及其酶学性质的研究 | 第43-51页 |
| 3.1.1 生物信息学分析 | 第43页 |
| 3.1.2 重组质粒的构建 | 第43-44页 |
| 3.1.3 Umxyn10A在大肠杆菌中的表达与纯化 | 第44-45页 |
| 3.1.4 重组木聚糖酶Umxyn10A的酶学性质 | 第45-51页 |
| 3.1.4.1 最适pH和最适温度 | 第45-46页 |
| 3.1.4.2 pH耐受性和热稳定性 | 第46-48页 |
| 3.1.4.3 金属离子、表面活性剂、螫合剂对木聚糖酶Umxyn10A酶活力的影响 | 第48页 |
| 3.1.4.4 底物特异性 | 第48-49页 |
| 3.1.4.5 木聚糖酶Umxyn10A的动力学参数 | 第49-50页 |
| 3.1.4.6 重组酶Umxyn10A对低聚木糖的水解 | 第50-51页 |
| 3.1.5 小结与讨论 | 第51页 |
| 3.2 木聚糖酶Umxyn10A的定点突变 | 第51-71页 |
| 3.2.1 突变位点的选择 | 第52-54页 |
| 3.2.2 突变酶基因的扩增 | 第54页 |
| 3.2.3 突变酶基因重组质粒的构建 | 第54-55页 |
| 3.2.4 突变酶基因在大肠杆菌中的诱导表达 | 第55-56页 |
| 3.2.5 突变酶重组蛋白的纯化 | 第56-57页 |
| 3.2.6 突变酶的酶学性质 | 第57-69页 |
| 3.2.6.1 突变酶的最适pH | 第57-58页 |
| 3.2.6.2 突变酶的最适温度 | 第58-60页 |
| 3.2.6.3 突变酶在不同温度下的热稳定性 | 第60-63页 |
| 3.2.6.4 突变酶Umxyn10A~(A31F)和Umxyn10A~(L307V)的热稳定性 | 第63-64页 |
| 3.2.6.5 突变酶Umxyn10A~(A31F)和Umxyn10A~(L307V)的pH耐受性 | 第64-65页 |
| 3.2.6.6 金属离子、表面活性剂和螯合剂对突变酶酶活力的影响 | 第65-66页 |
| 3.2.6.7 突变酶Umxyn10A~(A31F)和Umxyn10A~(L307V)动力学常数 | 第66-67页 |
| 3.2.6.8 突变酶Umxyn10A~(A31F)和Umxyn10A~(L307V)对低聚木糖的水解 | 第67-69页 |
| 3.2.7 小结与讨论 | 第69-71页 |
| 3.2.7.1 增加盐桥数目对木聚糖酶热稳定性的影响 | 第69页 |
| 3.2.7.2 二硫键对木聚糖酶热稳定性的影响 | 第69页 |
| 3.2.7.3 疏水相互作用对木聚糖酶热稳定性的影响 | 第69-70页 |
| 3.2.7.4 引入脯氨酸对木聚糖酶热稳定性的影响 | 第70-71页 |
| 3.3 耐热突变体的组合 | 第71-76页 |
| 3.3.1 突变酶Umxyn10A~(A31F/L307V)重组表达质粒的构建 | 第71-72页 |
| 3.3.3 突变酶Umxyn10A~(A31F/L307V)的表达与纯化 | 第72-73页 |
| 3.3.4 突变酶Umxyn10A~(A31F/L307V)的酶学特性 | 第73-75页 |
| 3.3.4.1 突变酶Umxyn10A~(A31F/L307V)的最适pH和最适温度 | 第73-74页 |
| 3.3.4.2 突变酶Umxyn10A~(A31F/L307V)的热稳定性 | 第74-75页 |
| 3.3.5 小结与讨论 | 第75-76页 |
| 第四章 总结与展望 | 第76-77页 |
| 参考文献 | 第77-86页 |
| 致谢 | 第86-87页 |
| 攻读硕士学位期间发表论文和发明专利情况 | 第87页 |
