| 基金资助 | 第3-5页 |
| 摘要 | 第5-7页 |
| ABSTRACT | 第7-8页 |
| 第一章 文献综述 | 第12-18页 |
| 1.1 小麦条锈病及研究现状 | 第12-13页 |
| 1.1.1 小麦条锈病的危害 | 第12页 |
| 1.1.2 引起小麦条锈病病原真菌的研究 | 第12-13页 |
| 1.1.3 小麦条锈病的研究现状 | 第13页 |
| 1.2 细胞信号转导 | 第13-14页 |
| 1.3 基因沉默技术 | 第14-16页 |
| 1.4 实验目的及意义和研究方法 | 第16-18页 |
| 1.4.1 实验目的及意义 | 第16-17页 |
| 1.4.2 研究方法 | 第17-18页 |
| 第二章 小麦条锈菌PsPKA基因的分离克隆及功能分析 | 第18-59页 |
| 2.1 实验材料、试剂及仪器 | 第18-19页 |
| 2.1.1 材料 | 第18页 |
| 2.1.2 试剂 | 第18页 |
| 2.1.3 仪器 | 第18-19页 |
| 2.2 实验方法 | 第19-42页 |
| 2.2.1 实验材料的准备 | 第19页 |
| 2.2.2 总RNA的提取 | 第19-21页 |
| 2.2.2.1 RNA耗材的处理 | 第19页 |
| 2.2.2.2 Biozol法提取RNA | 第19-20页 |
| 2.2.2.3 纯化提取RNA | 第20-21页 |
| 2.2.3 反转录cDNA第一链的合成 | 第21页 |
| 2.2.4 PsPKA的克隆及测序 | 第21-23页 |
| 2.2.4.1 引物的设计 | 第21页 |
| 2.2.4.2 PCR扩增 | 第21-22页 |
| 2.2.4.3 PCR产物的回收及连接 | 第22-23页 |
| 2.2.5 感受态细胞的制备、转化及阳性克隆的筛选、检测 | 第23-24页 |
| 2.2.5.1 大肠杆菌超级感受态细胞的制备 | 第23页 |
| 2.2.5.2 连接产物的转化及阳性克隆的筛选 | 第23-24页 |
| 2.2.5.3 阳性克隆的检测 | 第24页 |
| 2.2.6 质粒的小量提取及测序 | 第24-25页 |
| 2.2.7 生物信息学分析 | 第25页 |
| 2.2.8 Real-time PCR分析 | 第25-26页 |
| 2.2.9 BSMV-VIGS介导的PsPK4基因沉默 | 第26-29页 |
| 2.2.9.1 携带目标基因片段的重组载体的构建 | 第26-27页 |
| 2.2.9.2 病毒载体的线性化及体外转录 | 第27页 |
| 2.2.9.3 病毒载体的体外转录 | 第27-28页 |
| 2.2.9.4 病毒接种 | 第28页 |
| 2.2.9.5 条锈菌接种及取样 | 第28-29页 |
| 2.2.9.6 样品的处理、显微镜观察及数据统计 | 第29页 |
| 2.2.10 酵母双杂交分析 | 第29-31页 |
| 2.2.10.1 PsPrf1的转录因子活性分析 | 第29-30页 |
| 2.2.10.2 酵母双杂交载体的构建 | 第30-31页 |
| 2.2.10.3 酵母转化及蛋白互作分析 | 第31页 |
| 2.2.11 互补稻瘟菌突变体Mg△CPKA试验 | 第31-36页 |
| 2.2.11.1 引物设计 | 第31页 |
| 2.2.11.2 共转化插入DNA和载体的制备 | 第31-33页 |
| 2.2.11.3 稻瘟菌原生质体制备 | 第33-34页 |
| 2.2.11.4 稻瘟菌原生质体转化 | 第34页 |
| 2.2.11.5 瘟菌互补转化子的鉴定 | 第34-35页 |
| 2.2.11.6 稻瘟菌菌落生长速度及菌落特性 | 第35页 |
| 2.2.11.7 稻瘟菌附着孢形成实验 | 第35页 |
| 2.2.11.8 大麦接种试验 | 第35-36页 |
| 2.2.12 转基因 | 第36-42页 |
| 2.2.12.1 干涉载体的构建 | 第36页 |
| 2.2.12.2 表达质粒的大量提取 | 第36-37页 |
| 2.2.12.3 基因枪介导法转化小麦 | 第37-42页 |
| 2.2.12.4 转基因小麦后代植株的分子检测 | 第42页 |
| 2.3 结果分析 | 第42-57页 |
| 2.3.1 小麦条锈菌总RNA提取 | 第42-43页 |
| 2.3.2 小麦条锈菌PsPKA基因的克隆 | 第43页 |
| 2.3.3 PsPKA的序列分析 | 第43-46页 |
| 2.3.3.1 序列相似性分析 | 第43页 |
| 2.3.3.2 序列比对及系统发育树构建 | 第43-44页 |
| 2.3.3.3 蛋白特征预测 | 第44页 |
| 2.3.3.4 亚细胞定位及跨膜结构预测 | 第44页 |
| 2.3.3.5 基因编码氨基酸序列疏水性/亲水性分析 | 第44-45页 |
| 2.3.3.6 PsPKA蛋白的二级结构预测与分析 | 第45-46页 |
| 2.3.4 PsPKA的表达特征分析 | 第46-47页 |
| 2.3.5 PsPKA基因沉默分析 | 第47-51页 |
| 2.3.5.1 PsPKA基因沉默载体的构建 | 第47-48页 |
| 2.3.5.2 载体线性化及体外转录 | 第48页 |
| 2.3.5.3 BSMV病毒接种及病毒症状观察 | 第48-49页 |
| 2.3.5.4 条锈菌接种 | 第49-50页 |
| 2.3.5.5 接种条锈菌后的组织学观察 | 第50-51页 |
| 2.3.6 小麦条锈菌PsPKA蛋白与PsPrf1转录因子互作分析 | 第51-52页 |
| 2.3.6.1 PsPrf1转录激活作用验证 | 第51页 |
| 2.3.6.2 PsPKA蛋白与PsPrf1蛋白酵母双杂交分析 | 第51-52页 |
| 2.3.7 互补稻瘟菌突变体Mg△CPKA | 第52-55页 |
| 2.3.7.1 互补转化子的PCR鉴定 | 第52-53页 |
| 2.3.7.2 稻瘟菌菌落生长速度及菌落特性 | 第53-54页 |
| 2.3.7.3 稻瘟菌附着孢形成实验 | 第54页 |
| 2.3.7.4 大麦接种试验 | 第54-55页 |
| 2.3.8 转基因植株的PCR检测 | 第55-57页 |
| 2.4 结论与讨论 | 第57-59页 |
| 第三章 全文结论 | 第59-60页 |
| 参考文献 | 第60-66页 |
| 附录 | 第66-68页 |
| 致谢 | 第68-69页 |
| 作者简介 | 第69页 |
