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小麦条锈菌cAMP信号途径关键基因PsPKA的鉴定和功能分析

基金资助第3-5页
摘要第5-7页
ABSTRACT第7-8页
第一章 文献综述第12-18页
    1.1 小麦条锈病及研究现状第12-13页
        1.1.1 小麦条锈病的危害第12页
        1.1.2 引起小麦条锈病病原真菌的研究第12-13页
        1.1.3 小麦条锈病的研究现状第13页
    1.2 细胞信号转导第13-14页
    1.3 基因沉默技术第14-16页
    1.4 实验目的及意义和研究方法第16-18页
        1.4.1 实验目的及意义第16-17页
        1.4.2 研究方法第17-18页
第二章 小麦条锈菌PsPKA基因的分离克隆及功能分析第18-59页
    2.1 实验材料、试剂及仪器第18-19页
        2.1.1 材料第18页
        2.1.2 试剂第18页
        2.1.3 仪器第18-19页
    2.2 实验方法第19-42页
        2.2.1 实验材料的准备第19页
        2.2.2 总RNA的提取第19-21页
            2.2.2.1 RNA耗材的处理第19页
            2.2.2.2 Biozol法提取RNA第19-20页
            2.2.2.3 纯化提取RNA第20-21页
        2.2.3 反转录cDNA第一链的合成第21页
        2.2.4 PsPKA的克隆及测序第21-23页
            2.2.4.1 引物的设计第21页
            2.2.4.2 PCR扩增第21-22页
            2.2.4.3 PCR产物的回收及连接第22-23页
        2.2.5 感受态细胞的制备、转化及阳性克隆的筛选、检测第23-24页
            2.2.5.1 大肠杆菌超级感受态细胞的制备第23页
            2.2.5.2 连接产物的转化及阳性克隆的筛选第23-24页
            2.2.5.3 阳性克隆的检测第24页
        2.2.6 质粒的小量提取及测序第24-25页
        2.2.7 生物信息学分析第25页
        2.2.8 Real-time PCR分析第25-26页
        2.2.9 BSMV-VIGS介导的PsPK4基因沉默第26-29页
            2.2.9.1 携带目标基因片段的重组载体的构建第26-27页
            2.2.9.2 病毒载体的线性化及体外转录第27页
            2.2.9.3 病毒载体的体外转录第27-28页
            2.2.9.4 病毒接种第28页
            2.2.9.5 条锈菌接种及取样第28-29页
            2.2.9.6 样品的处理、显微镜观察及数据统计第29页
        2.2.10 酵母双杂交分析第29-31页
            2.2.10.1 PsPrf1的转录因子活性分析第29-30页
            2.2.10.2 酵母双杂交载体的构建第30-31页
            2.2.10.3 酵母转化及蛋白互作分析第31页
        2.2.11 互补稻瘟菌突变体Mg△CPKA试验第31-36页
            2.2.11.1 引物设计第31页
            2.2.11.2 共转化插入DNA和载体的制备第31-33页
            2.2.11.3 稻瘟菌原生质体制备第33-34页
            2.2.11.4 稻瘟菌原生质体转化第34页
            2.2.11.5 瘟菌互补转化子的鉴定第34-35页
            2.2.11.6 稻瘟菌菌落生长速度及菌落特性第35页
            2.2.11.7 稻瘟菌附着孢形成实验第35页
            2.2.11.8 大麦接种试验第35-36页
        2.2.12 转基因第36-42页
            2.2.12.1 干涉载体的构建第36页
            2.2.12.2 表达质粒的大量提取第36-37页
            2.2.12.3 基因枪介导法转化小麦第37-42页
            2.2.12.4 转基因小麦后代植株的分子检测第42页
    2.3 结果分析第42-57页
        2.3.1 小麦条锈菌总RNA提取第42-43页
        2.3.2 小麦条锈菌PsPKA基因的克隆第43页
        2.3.3 PsPKA的序列分析第43-46页
            2.3.3.1 序列相似性分析第43页
            2.3.3.2 序列比对及系统发育树构建第43-44页
            2.3.3.3 蛋白特征预测第44页
            2.3.3.4 亚细胞定位及跨膜结构预测第44页
            2.3.3.5 基因编码氨基酸序列疏水性/亲水性分析第44-45页
            2.3.3.6 PsPKA蛋白的二级结构预测与分析第45-46页
        2.3.4 PsPKA的表达特征分析第46-47页
        2.3.5 PsPKA基因沉默分析第47-51页
            2.3.5.1 PsPKA基因沉默载体的构建第47-48页
            2.3.5.2 载体线性化及体外转录第48页
            2.3.5.3 BSMV病毒接种及病毒症状观察第48-49页
            2.3.5.4 条锈菌接种第49-50页
            2.3.5.5 接种条锈菌后的组织学观察第50-51页
        2.3.6 小麦条锈菌PsPKA蛋白与PsPrf1转录因子互作分析第51-52页
            2.3.6.1 PsPrf1转录激活作用验证第51页
            2.3.6.2 PsPKA蛋白与PsPrf1蛋白酵母双杂交分析第51-52页
        2.3.7 互补稻瘟菌突变体Mg△CPKA第52-55页
            2.3.7.1 互补转化子的PCR鉴定第52-53页
            2.3.7.2 稻瘟菌菌落生长速度及菌落特性第53-54页
            2.3.7.3 稻瘟菌附着孢形成实验第54页
            2.3.7.4 大麦接种试验第54-55页
        2.3.8 转基因植株的PCR检测第55-57页
    2.4 结论与讨论第57-59页
第三章 全文结论第59-60页
参考文献第60-66页
附录第66-68页
致谢第68-69页
作者简介第69页

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