| 摘要 | 第7-8页 |
| ABSTRACT | 第8-9页 |
| 第一篇 文献综述 | 第10-32页 |
| 1 前言 | 第10-11页 |
| 2 猪流行性腹泻病毒分子特征 | 第11-12页 |
| 2.1 PEDV的基因组组成和病毒结构 | 第11-12页 |
| 2.2 猪流行性腹泻病毒主要编码蛋白 | 第12页 |
| 3 PEDV受体猪氨基肽酶(PAPN)概述 | 第12-13页 |
| 4 PEDV宿主相互作用 | 第13-15页 |
| 5 细菌人工染色体技术(BACS)概述 | 第15-16页 |
| 6 CRISPR/CAS9技术简介 | 第16-22页 |
| 参考文献 | 第22-32页 |
| 第二篇 研究内容 | 第32-84页 |
| 第一章 应用细菌人工染色体(BACS)技术构建PEDV感染性克隆 | 第32-54页 |
| 1 材料 | 第33-34页 |
| 1.1 质粒和菌株 | 第33页 |
| 1.2 主要试剂 | 第33页 |
| 1.3 主要仪器设备 | 第33-34页 |
| 2 试验方法 | 第34-44页 |
| 2.1 临床流行株PEDV-CHZ全基因组测序 | 第34-35页 |
| 2.2 病毒基因组中限制性内切酶的选择 | 第35页 |
| 2.3 构建中间质粒作为构建全长cDNA感染性克隆的骨架 | 第35-36页 |
| 2.4 BAC质粒的分离和提取 | 第36-39页 |
| 2.5 DH10B电转感受态的制备 | 第39页 |
| 2.6 目的片段的制备 | 第39-42页 |
| 2.7 pBeloBACll质粒及目的片段的酶切及回收 | 第42-43页 |
| 2.8 连接、转化及鉴定 | 第43-44页 |
| 3 结果 | 第44-49页 |
| 3.1 临床流行株全基因组测序 | 第44页 |
| 3.2 酶切位点的选择 | 第44-45页 |
| 3.3 中间质粒插入元件的构建 | 第45-46页 |
| 3.4 pBeloBACll质粒的鉴定 | 第46-47页 |
| 3.5 中间质粒的构建 | 第47-48页 |
| 3.6 目的片段的扩增 | 第48-49页 |
| 4 讨论 | 第49-51页 |
| 参考文献 | 第51-54页 |
| 第二章 PAPN稳定表达细胞系的构建 | 第54-84页 |
| 1 材料和试剂 | 第55-56页 |
| 1.1 细胞系、质粒及菌株 | 第55页 |
| 1.2 主要试剂 | 第55页 |
| 1.3 主要仪器设备 | 第55-56页 |
| 2 试验方法 | 第56-68页 |
| 2.1 pAPN真核表达基因片段的扩增 | 第56-57页 |
| 2.2 pAPN基因及真核表达载体的克隆 | 第57-58页 |
| 2.3 重组真核表达质粒pIRES2-EGFP-pAPN的构建 | 第58-59页 |
| 2.4 重组质粒pIRES2-EGFP-pAPN的鉴定 | 第59-60页 |
| 2.5 构建包含特异性靶向位点的重组质粒 | 第60-61页 |
| 2.6 PX330质粒的改造 | 第61页 |
| 2.7 G418最佳筛选浓度的确定 | 第61-62页 |
| 2.8 重组质粒转染ST/PK细胞 | 第62-63页 |
| 2.9 稳定单细胞克隆株的筛选 | 第63-64页 |
| 2.10 稳定细胞株相关验证试验 | 第64-68页 |
| 3 结果 | 第68-79页 |
| 3.1 pAPN基因PCR扩增结果 | 第68页 |
| 3.2 重组质粒pIRES2-EGFP-pAPN双酶切鉴定 | 第68-69页 |
| 3.3 重组质粒pIRES2-EGFP-pAPN的测序结果 | 第69-70页 |
| 3.4 构建包含特异性靶向位点的重组质粒 | 第70-72页 |
| 3.5 PX330质粒的改造 | 第72页 |
| 3.6 G418最佳筛选浓度的确定 | 第72-74页 |
| 3.7 重组质粒转染ST/PK细胞 | 第74页 |
| 3.8 单细胞克隆株的荧光显微镜检测 | 第74-75页 |
| 3.9 RT-PCR对阳性单细胞克隆株pAPN基因转录水平的检测 | 第75页 |
| 3.10 Western-blot对阳性单细胞克隆株pAPN表达水平的检测 | 第75-76页 |
| 3.11 间接免疫荧光试验对细胞株pAPN表达水平的检测 | 第76-78页 |
| 3.12 阳性单细胞克隆株对PEDV易感性的检测 | 第78页 |
| 3.13 荧光定量PCR对细胞株PEDV吸附能力的检测 | 第78-79页 |
| 4 讨论 | 第79-81页 |
| 参考文献 | 第81-84页 |
| 全文总结 | 第84-86页 |
| 致谢 | 第86页 |
