| 摘要 | 第9-11页 |
| 缩略词 | 第11-12页 |
| 第一章 文献综述 | 第12-25页 |
| 1 脂肪形成的过程 | 第12-14页 |
| 2 BCAA生理代谢特点 | 第14-16页 |
| 2.1 BCAA代谢与脂肪组织的形成 | 第15-16页 |
| 2.2 BCAA对机体糖脂代谢的调控 | 第16页 |
| 2.2.1 BCAA对糖代谢的调控 | 第16页 |
| 2.2.2 BCAA对脂代谢的调控 | 第16页 |
| 3 BCKDH的分子结构及基因型 | 第16-17页 |
| 4 BCKDHA的生物学功能 | 第17页 |
| 5 miRNA在脂肪中的作用 | 第17-19页 |
| 5.1 促进脂肪细胞分化的miRNAs | 第17-18页 |
| 5.2 抑制脂肪细胞分化的miRNAs | 第18页 |
| 5.3 miRNA与脂代谢 | 第18-19页 |
| 6 本研究的目的与意义 | 第19-20页 |
| 参考文献 | 第20-25页 |
| 第二章 BCKDKA基因生物信息学分析与过表达载体的构建 | 第25-44页 |
| 1 材料与方法 | 第25-32页 |
| 1.1 生物信息学分析方法 | 第25-26页 |
| 1.1.1 BCKDHA基因mRNA和蛋白质序列的获取 | 第25-26页 |
| 1.1.2 mRNA和蛋白质序列分析方法 | 第26页 |
| 1.2 生物信息学预测与BCKDHA具有靶标关系的miRNAs | 第26页 |
| 1.3 BCKDHA基因双荧光报告载体的构建 | 第26-32页 |
| 1.3.1 试验动物及样品采集 | 第26页 |
| 1.3.2 试验试剂和仪器 | 第26-27页 |
| 1.3.3 试验方法 | 第27-32页 |
| 2 结果分析 | 第32-37页 |
| 2.1 绵羊BCKDHA基因及蛋白的生物信息学分析 | 第32-35页 |
| 2.1.1 绵羊BCKDHA蛋白的基本理化性质 | 第32-33页 |
| 2.1.2 绵羊BCKDHA蛋白信号肽和跨膜域 | 第33页 |
| 2.1.3 BCKDHA糖基化位点以及磷酸化位点 | 第33页 |
| 2.1.4 BCKDHA蛋白的二级结构 | 第33-34页 |
| 2.1.5 序列的相似性 | 第34页 |
| 2.1.6 聚类分析 | 第34-35页 |
| 2.2 与BCKDHA具有靶标关系的miRNAs | 第35页 |
| 2.3 BCKDHA与miR-194-5p靶结合位点 | 第35-36页 |
| 2.4 BCKDHA双荧光报告载体构建结果 | 第36-37页 |
| 2.4.1 总RNA检测结果 | 第36页 |
| 2.4.2 BCKDHA基因扩增和双酶切 | 第36-37页 |
| 2.4.3 pmir-BCKDHA双荧光报告载体 | 第37页 |
| 3 讨论 | 第37-39页 |
| 3.1 物种间BCKDHA核苷酸和氨基酸序列的差异 | 第37-38页 |
| 3.2 绵羊BCKDHA的信号肽和翻译后修饰 | 第38页 |
| 3.3 BCKDHA的进化 | 第38-39页 |
| 3.4 靶基因预测 | 第39页 |
| 4 小结 | 第39-41页 |
| 参考文献 | 第41-44页 |
| 第三章 MiR-194-5p与BCKDHA靶标关系的验证及二者对绵羊脂代谢的调控 | 第44-65页 |
| 1 材料与方法 | 第44-56页 |
| 1.1 试验动物及样品采集 | 第44页 |
| 1.2 实验试剂和仪器 | 第44-46页 |
| 1.2.1 主要试验试剂 | 第44-45页 |
| 1.2.2 主要试验仪器 | 第45-46页 |
| 1.2.3 试验溶液的配制 | 第46页 |
| 1.3 细胞的培养 | 第46-48页 |
| 1.3.1 SVF细胞的培养 | 第46-47页 |
| 1.3.2 SVF细胞的传代 | 第47页 |
| 1.3.3 SVF细胞的冻存 | 第47页 |
| 1.3.4 SVF细胞的复苏 | 第47-48页 |
| 1.3.5 SVF细胞的分化 | 第48页 |
| 1.3.6 HEK293T细胞的培养 | 第48页 |
| 1.4 靶基因的验证 | 第48-49页 |
| 1.4.1 载体pmir-BCKDHA与miR-194-5p mimic共转染 | 第48页 |
| 1.4.2 双荧光素酶检测 | 第48-49页 |
| 1.5 miR-194-5p mimic转染SVF细胞 | 第49页 |
| 1.5.1 油红O染色 | 第49页 |
| 1.5.2 分化的细胞及转染的细胞总RNA的提取 | 第49页 |
| 1.6 荧光定量PCR分析 | 第49-52页 |
| 1.6.1 miR-194-5p特异性反转录茎环引物的设计 | 第49-50页 |
| 1.6.2 miR-194-5p和BCKDHA荧光定量PCR引物设计 | 第50页 |
| 1.6.3 miR-194-5p表达量的检测 | 第50-51页 |
| 1.6.4 BCKDHA mRNA表达量的检测 | 第51-52页 |
| 1.7 数据分析 | 第52页 |
| 1.8 Western blotting试验方法 | 第52-56页 |
| 1.8.1 绵羊SVF细胞总蛋白的提取 | 第52页 |
| 1.8.2 BCA蛋白定量原理及流程 | 第52-53页 |
| 1.8.3 SDS-PAGE电泳 | 第53-54页 |
| 1.8.4 蛋白完整性检测 | 第54-55页 |
| 1.8.5 转膜 | 第55页 |
| 1.8.6 封闭及抗体孵育 | 第55页 |
| 1.8.7 显色 | 第55页 |
| 1.8.8 内参蛋白的抗体孵育 | 第55-56页 |
| 1.8.9 Westm blotting试验结果的分析 | 第56页 |
| 1.9 数据处理与分析 | 第56页 |
| 2 结果与分析 | 第56-61页 |
| 2.1 miR-194-5p与BCKDHA基因的靶标关系及调控机制 | 第56-57页 |
| 2.2 miR-194-5p与BCKDHA基因对SVF细胞分化的影响 | 第57-58页 |
| 2.2.1 正常细胞分化期miR-194-5p和BCKDHA mRNA的表达量 | 第57页 |
| 2.2.2 过表达miR-194-5p后细胞的外观变化 | 第57-58页 |
| 2.3 转染miR-194-5p后miR-194-5p和BCKDHA mRNA的表达量 | 第58-60页 |
| 2.3.1 过表达miR-194-5p后miR-194-5p和BCKDHA mRNA的表达量 | 第58-59页 |
| 2.3.2 抑制miR-194-5p后miR-194-5p和BCKDHA mRNA表达量 | 第59-60页 |
| 2.4 转染miR-1 94-5p mimic和inhibitor后BCKDHA蛋白的表达量 | 第60-61页 |
| 2.4.1 SVF细胞中的总蛋白 | 第60页 |
| 2.4.2 BCKDHA蛋白的表达量 | 第60-61页 |
| 3 讨论 | 第61-62页 |
| 4 小结 | 第62-63页 |
| 参考文献 | 第63-65页 |
| 全文结论 | 第65-66页 |
| 创新与特色 | 第66-67页 |
| Abstract | 第67-68页 |
| 附录 | 第69-71页 |
| 致谢 | 第71页 |
