| 摘要 | 第10-12页 |
| Abstract | 第12-14页 |
| 缩略词表(Abbreviation) | 第15-17页 |
| 1序言 | 第17-32页 |
| 1.1 藻胆体和藻胆蛋白 | 第17-21页 |
| 1.1.1 藻胆体 | 第17-18页 |
| 1.1.2 藻胆蛋白研究进展 | 第18页 |
| 1.1.3 胆色素的研究进展 | 第18-20页 |
| 1.1.4 藻胆蛋白裂合酶研究进展 | 第20-21页 |
| 1.2 光敏色素研究进展 | 第21-23页 |
| 1.2.1 蓝细菌光敏色素 | 第22页 |
| 1.2.2 其它的光敏色素 | 第22-23页 |
| 1.3 荧光蛋白的研究进展 | 第23-28页 |
| 1.3.1 GFP类荧光蛋白的研究进展 | 第23-24页 |
| 1.3.2 结合BV色素的近红外荧光蛋白的研究进展 | 第24-26页 |
| 1.3.3 结合胆红素的荧光蛋白的研究 | 第26-27页 |
| 1.3.4 荧光蛋白应用的研究进展 | 第27-28页 |
| 1.3.5 超分辨成像的研究进展 | 第28页 |
| 1.4 光遗传学和光生物学 | 第28-30页 |
| 1.4.1 基于蓝光和青光的光遗传学开关 | 第29页 |
| 1.4.2 基于远红光调控的光遗传学开关 | 第29-30页 |
| 1.5 本课题研究目的和意义 | 第30-32页 |
| 2.裂合酶CpcT的研究 | 第32-65页 |
| 2.1 引言 | 第32页 |
| 2.2 材料与仪器 | 第32-37页 |
| 2.2.1 主要材料 | 第32-33页 |
| 2.2.2 培养基和试剂 | 第33-36页 |
| 2.2.3 主要实验仪器 | 第36-37页 |
| 2.3 实验方法 | 第37-47页 |
| 2.3.1 感受态细胞的制备及转化 | 第37-38页 |
| 2.3.2 定点诱变和缺失诱变 | 第38-40页 |
| 2.3.3 定点和缺失突变体活性的测定 | 第40页 |
| 2.3.4 脱辅基蛋白的大量表达 | 第40-41页 |
| 2.3.5 CpcT硒代蛋白的大量表达 | 第41页 |
| 2.3.6 镍离子螯合亲和层析纯化目的蛋白 | 第41-42页 |
| 2.3.7 色素和脱辅基蛋白浓度的测定 | 第42页 |
| 2.3.8 SDS-PAGE和锌电泳 | 第42-43页 |
| 2.3.9 目的蛋白质聚集态分析 | 第43-44页 |
| 2.3.10 CpcT与PCB的Pull-down测定 | 第44-45页 |
| 2.3.11 荧光量子产率的计算 | 第45页 |
| 2.3.12 CpcT催化体外重组 | 第45页 |
| 2.3.13 硒代晶体结晶条件的摸索及优化 | 第45-46页 |
| 2.3.14 紫外可见吸收光谱和荧光光谱的测定 | 第46-47页 |
| 2.3.15 保守序列的分析 | 第47页 |
| 2.4 结果与分析 | 第47-63页 |
| 2.4.1 CpcT硒代甲硫氨酸蛋白的表达与纯化 | 第47-48页 |
| 2.4.2 CpcT硒代甲硫氨酸蛋白结晶条件的优化 | 第48页 |
| 2.4.3 CpcT晶体结构的概述 | 第48-51页 |
| 2.4.4 CpcT的N端测序 | 第51页 |
| 2.4.5 CpcT定点突变对催化活性的影响 | 第51-53页 |
| 2.4.6 CpcT聚集态分析 | 第53-56页 |
| 2.4.7 CpcT及突变体与PCB的Pull-downAssay | 第56-60页 |
| 2.4.8 氧化型谷胱甘肽对CpcT催化活性的影响分析 | 第60-61页 |
| 2.4.9 CpcB生物信息学分析 | 第61页 |
| 2.4.10 CpcT与CpcB嵌合模型 | 第61-62页 |
| 2.4.11 CpcT催化机理 | 第62-63页 |
| 2.5 本章小结 | 第63-65页 |
| 3.7120核膜连接蛋白ApcE诱变体的研究 | 第65-94页 |
| 3.1 引言 | 第65页 |
| 3.2 材料与仪器 | 第65-66页 |
| 3.2.1 主要材料 | 第65页 |
| 3.2.2 培养基和试剂 | 第65-66页 |
| 3.2.3 主要实验仪器 | 第66页 |
| 3.3 实验方法 | 第66-71页 |
| 3.3.1 ApcEΔΔ的构建 | 第66-67页 |
| 3.3.2 蛋白质的表达与纯化 | 第67页 |
| 3.3.3 SDS-PAGE和醋酸锌染色 | 第67页 |
| 3.3.4 蛋白质吸收光谱和荧光光谱的测定 | 第67-68页 |
| 3.3.5 荧光量子产率及摩尔消光系数的测定 | 第68-69页 |
| 3.3.6 圆二色光谱的测定及分析 | 第69-70页 |
| 3.3.7 动态光谱和动力学的测定 | 第70页 |
| 3.3.8 荧光寿命的测定 | 第70-71页 |
| 3.3.9 聚集态的分析 | 第71页 |
| 3.3.10 热力学分析 | 第71页 |
| 3.4 结果与分析 | 第71-92页 |
| 3.4.1 PCB-ApcEΔΔ的稳态光谱分析 | 第71-73页 |
| 3.4.2 PCB-ApcEΔΔ在不同浓度尿素条件下的吸收光谱分析 | 第73-75页 |
| 3.4.3 PCB-ApcEΔΔ不同浓度尿素条件下荧光光谱分析 | 第75-76页 |
| 3.4.4 PCB-ApcEΔΔ不同浓度尿素条件下动力学分析 | 第76-79页 |
| 3.4.5 温度对PCB-ApcEΔΔ光谱影响的分析 | 第79-81页 |
| 3.4.6 PEB-ApcEΔΔ稳态光谱分析 | 第81-82页 |
| 3.4.7 DEAE阴离子交换层析纯化PCB-ApcEΔΔ | 第82-83页 |
| 3.4.8 荧光寿命的测定 | 第83-85页 |
| 3.4.9 ApcEΔΔ与色素的连接方式 | 第85页 |
| 3.4.10 ApcEΔΔ二级结构的分析 | 第85-87页 |
| 3.4.11 ApcEΔΔ的聚集态分析 | 第87-89页 |
| 3.4.12 ApcEΔΔ三维结构分析 | 第89-90页 |
| 3.4.13 ApcEΔΔ状态变化热力学分析 | 第90-92页 |
| 3.5 小结与讨论 | 第92-94页 |
| 4 远红光光适应藻中藻胆蛋白的分析 | 第94-101页 |
| 4.1 引言 | 第94页 |
| 4.2 材料与仪器 | 第94-95页 |
| 4.2.1 主要材料 | 第94页 |
| 4.2.2 培养基和试剂 | 第94页 |
| 4.2.3 主要实验仪器 | 第94-95页 |
| 4.3 实验方法 | 第95页 |
| 4.3.1 藻胆蛋白序列比对和进化树的分析 | 第95页 |
| 4.3.2 蛋白的表达与纯化 | 第95页 |
| 4.3.3 光谱的测定 | 第95页 |
| 4.4 结果与分析 | 第95-100页 |
| 4.4.1 核膜连接蛋白ApcE的生物信息分析 | 第95-97页 |
| 4.4.2 别藻蓝蛋白α亚基的生物信息学分析 | 第97-98页 |
| 4.4.3 别藻蓝蛋白β亚基的生物信息学分析 | 第98页 |
| 4.4.4 ApcE2的光谱分析 | 第98-99页 |
| 4.4.5 ApcF2的光谱分析 | 第99-100页 |
| 4.5 本章小结 | 第100-101页 |
| 5 基于ApcF2近红外荧光探针的分子进化 | 第101-165页 |
| 5.1 引言 | 第101-102页 |
| 5.2 材料与仪器 | 第102-104页 |
| 5.2.1 主要材料 | 第102页 |
| 5.2.2 培养基和试剂 | 第102-104页 |
| 5.2.3 主要实验仪器 | 第104页 |
| 5.3 实验方法 | 第104-127页 |
| 5.3.1 随机诱变的方法与诱变体库的构建 | 第104-106页 |
| 5.3.2 特定位点的饱和诱变 | 第106-108页 |
| 5.3.3 特定位点的定点诱变 | 第108-109页 |
| 5.3.4 诱变库的筛选 | 第109-110页 |
| 5.3.5 诱变体的表达以及进一步的纯化和鉴定 | 第110页 |
| 5.3.6 光谱参数的测定 | 第110-111页 |
| 5.3.7 诱变体的进一步鉴定及测序 | 第111页 |
| 5.3.8 序列比对 | 第111页 |
| 5.3.9 三维结构的模拟 | 第111-112页 |
| 5.3.10 动物细胞的培养与转染 | 第112-113页 |
| 5.3.11 动物细胞表达质粒的构建 | 第113-114页 |
| 5.3.12 动物细胞标记质粒的构建 | 第114-116页 |
| 5.3.13 乳酸菌表面展示法测定荧光蛋白的pH稳定性和热稳定性 | 第116-117页 |
| 5.3.14 乳酸菌细胞内表达测定荧光蛋白pH稳定性 | 第117-119页 |
| 5.3.15 BDFPs与BV的体外重组 | 第119-120页 |
| 5.3.16 荧光蛋白光稳定性的测定 | 第120-121页 |
| 5.3.17 荧光蛋白热稳定性的测定 | 第121页 |
| 5.3.18 荧光蛋白pH稳定性 | 第121页 |
| 5.3.19 荧光蛋白在盐酸胍下的稳定性 | 第121-122页 |
| 5.3.20 荧光蛋白体外聚集态的分析 | 第122页 |
| 5.3.21 OSER测定荧光蛋白细胞内的聚集态分析 | 第122-124页 |
| 5.3.22 BDFPs标记细胞的Widefield和SIM观察 | 第124页 |
| 5.3.23 流式细胞仪分析 | 第124-125页 |
| 5.3.24 质谱与N端测序 | 第125页 |
| 5.3.25 线虫的培养、注射及显微镜的观察 | 第125页 |
| 5.3.26 荧光蛋白在细胞内亮度的比较 | 第125-126页 |
| 5.3.27 结晶条件的筛选 | 第126-127页 |
| 5.4 基于ApcF2近红外荧光探针-BDFPs的分子进化和筛选 | 第127-145页 |
| 5.4.1 结合胆绿素BV诱变体的获得 | 第128-130页 |
| 5.4.2 近红外荧光探针BDFP1.0的筛选 | 第130-132页 |
| 5.4.3 近红外荧光探针BDFP1.1的筛选 | 第132-135页 |
| 5.4.4 近红外荧光探针BDFP1.1的单体化 | 第135-141页 |
| 5.4.5 OSER测定分析荧光探针细胞内聚集态 | 第141-145页 |
| 5.5 BDFPs稳定性的研究 | 第145-150页 |
| 5.5.1 BDFPs的热动力学稳定性的研究 | 第145-146页 |
| 5.5.2 BDFPs的光稳定性研究 | 第146-149页 |
| 5.5.3 BDFPspH稳定性的研究 | 第149-150页 |
| 5.6 BDFPs与其他近红外荧光探针细胞亮度的比较 | 第150-153页 |
| 5.6.1 BDFP1.1与smURFP和R5-2细胞亮度比较 | 第150-151页 |
| 5.6.2 BDFPs在不同条件下细胞亮度及与IFP2.0的比较 | 第151-153页 |
| 5.7 BDFPs与BV色素的体外重组 | 第153-157页 |
| 5.8 BDFPs在动物细胞和线虫中标记实例 | 第157-162页 |
| 5.8.1 BDFPs在动物细胞中标记 | 第157-159页 |
| 5.8.2 BDFP1.1在线虫中表达 | 第159-162页 |
| 5.9 BDFP1.1晶体的筛选 | 第162-163页 |
| 5.10 小结与讨论 | 第163-165页 |
| 参考文献 | 第165-180页 |
| 附录1 攻读学位期间发表的学术论文 | 第180-181页 |
| 致谢 | 第181-183页 |
