| 摘要 | 第5-6页 |
| Abstract | 第6-7页 |
| 第一章 研究背景 | 第13-39页 |
| 1.1. 谷胱甘肽 | 第13-14页 |
| 1.2. 蛋白质谷胱甘肽化和去谷胱甘肽化反应 | 第14-16页 |
| 1.2.1. 蛋白质的谷胱甘肽化反应 | 第14-16页 |
| 1.2.2. 蛋白质的去谷胱甘肽化反应 | 第16页 |
| 1.3. 硫氧还蛋白概述 | 第16-20页 |
| 1.3.1. 硫氧还蛋白的结构 | 第17-18页 |
| 1.3.2. 硫氧还蛋白、硫氧还蛋白还原酶和NADPH还原体系 | 第18-19页 |
| 1.3.3. 硫氧还蛋白的催化机制 | 第19页 |
| 1.3.4. 酵母中硫氧还蛋白 | 第19-20页 |
| 1.4. 谷氧还蛋白概述 | 第20-28页 |
| 1.4.1. 谷氧还蛋白的结构 | 第20-22页 |
| 1.4.2. 谷氧还蛋白分类 | 第22-24页 |
| 1.4.3. 谷氧还蛋白催化机理 | 第24-25页 |
| 1.4.4. 谷氧还蛋白的催化活性 | 第25-26页 |
| 1.4.5. 谷氧还蛋白的功能 | 第26-28页 |
| 1.5. 酿酒酵母谷氧还蛋白概述 | 第28-31页 |
| 1.5.1. 谷氧还蛋白Grx1和Grx2 | 第28-29页 |
| 1.5.2. 谷氧还蛋白Grx5 | 第29-30页 |
| 1.5.3. 谷氧还蛋白Grx6和Grx7 | 第30-31页 |
| 1.5.4. 谷氧还蛋白Grx8 | 第31页 |
| 1.6. 谷氧还蛋白Grx3和Grx4生化研究 | 第31-36页 |
| 1.6.1. Grx3和Grx4氧化还原活性 | 第31-32页 |
| 1.6.2. Grx3和Grx4参与Fe-S簇代谢研究 | 第32-36页 |
| 1.6.2.1. 铁在细胞中的作用 | 第32-33页 |
| 1.6.2.2. Fra2/Grx3/Grx4参与调控转录因子Aft2 | 第33-36页 |
| 1.7. 靶标谷氧还蛋白Grx3的研究意义 | 第36-39页 |
| 第二章 实验材料、设备与方法 | 第39-69页 |
| 2.1. 实验材料和设备 | 第39-41页 |
| 2.1.1. 菌株和质粒 | 第39页 |
| 2.1.2. 试剂、酶 | 第39-40页 |
| 2.1.3. 仪器设备 | 第40-41页 |
| 2.2. 实验方法 | 第41-69页 |
| 2.2.1. 分子克隆 | 第41-53页 |
| 2.2.1.1. 目的基因序列的获取 | 第41-43页 |
| 2.2.1.2. 靶目的基因的生物信息学分析 | 第43-44页 |
| 2.2.1.3. 不同版本蛋白的设计 | 第44页 |
| 2.2.1.4. 目的基因扩增 | 第44-45页 |
| 2.2.1.5. PCR定点突变实验 | 第45-46页 |
| 2.2.1.6. PCR产物的鉴定 | 第46页 |
| 2.2.1.7. PCR产物的回收 | 第46-47页 |
| 2.2.1.8. 质粒载体扩增和抽提 | 第47-48页 |
| 2.2.1.9. 重组质粒的构建和鉴定 | 第48-49页 |
| 2.2.1.10. 重组质粒的构建 | 第49-50页 |
| 2.2.1.11. 重组质粒的鉴定 | 第50-51页 |
| 2.2.1.12. 基因测序鉴定 | 第51页 |
| 2.2.1.13. 重组PCR | 第51-53页 |
| 2.2.2. 蛋白质的表达纯化 | 第53-58页 |
| 2.2.2.1. 目的蛋白的检测表达 | 第53-54页 |
| 2.2.2.2. 目的蛋白的大量表达 | 第54-56页 |
| 2.2.2.3. 目的蛋白的纯化 | 第56-57页 |
| 2.2.2.4. 蛋白质纯度及分子量鉴定 | 第57-58页 |
| 2.2.2.5. 蛋白质浓度测定 | 第58页 |
| 2.2.3. 蛋白质结晶 | 第58-60页 |
| 2.2.3.1 手工初筛:座滴法 | 第59页 |
| 2.2.3.2 晶体鉴定 | 第59-60页 |
| 2.2.3.3 晶体优化 | 第60页 |
| 2.2.4. 晶体结构解析和精修 | 第60页 |
| 2.2.5. NMR结构的样品数据收集、处理和评估 | 第60-61页 |
| 2.2.6. 核磁滴定实验: | 第61-62页 |
| 2.2.7. HEDS酶活测定 | 第62-63页 |
| 2.2.8. GST活性实验 | 第63页 |
| 2.2.9. NADPH-硫氧还蛋白还原酶-Trx酶活体系 | 第63-64页 |
| 2.2.10. 交联实验分析Grx与Trx结构域相互作用 | 第64页 |
| 2.2.11. pull-down结合实验 | 第64-65页 |
| 2.2.12. 表面等离子共振(SPR)实验 | 第65-66页 |
| 2.2.13. 计算机模拟底物结合 | 第66页 |
| 2.2.14. 荧光偏振分析实验 | 第66-69页 |
| 第三章 结果与讨论 | 第69-97页 |
| 3.1. Grx3和Fra2的生物信息学分析 | 第69-72页 |
| 3.1.1. Grx3的生物信息学分析 | 第69-71页 |
| 3.1.2. Fra2的生物信息学分析 | 第71-72页 |
| 3.2. Grx3、Fra2和Aft2的分子克隆、表达和纯化 | 第72-75页 |
| 3.3. Grx3的Trx和Grx结构域的晶体学研究 | 第75-80页 |
| 3.3.1. Grx3的Trx结构域和Grx结构域的蛋白质结晶 | 第75-76页 |
| 3.3.2. Grx3的Trx和Grx结构域的数据收集、结构解析和精修 | 第76-78页 |
| 3.3.3. Grx3的Trx结构域和Grx结构域的结构 | 第78-80页 |
| 3.4. 体外实验验证Grx3全长结构 | 第80-85页 |
| 3.4.1. Grx3具有经典HEDS和GST活性 | 第80-82页 |
| 3.4.2. 体外交联实验验证Trx结构域与Grx结构域相互作用 | 第82-83页 |
| 3.4.3. NADPH-硫氧还蛋白还原酶-Trx酶活体系验证相互作用 | 第83-84页 |
| 3.4.4. Grx3的全长结构模拟 | 第84-85页 |
| 3.5. Fra2的NMR结构结构解析 | 第85-88页 |
| 3.5.1. Fra2的NMR结构的样品准备、数据收集、处理和评估 | 第85-87页 |
| 3.5.2. Fra2的NMR结构 | 第87-88页 |
| 3.6. Fra2与Grx3的相互作用模型体外实验 | 第88-93页 |
| 3.6.1. 核磁滴定实验 | 第88-89页 |
| 3.6.2. SPR确定Grx结构域相互作用位置 | 第89-91页 |
| 3.6.3. Grx3~(Grx)-Fra2复合物的模型 | 第91页 |
| 3.6.4. [2Fe-2S]-Grx3~(Grx)-Fra2异源二聚体模型 | 第91-93页 |
| 3.7. Fra2、Aft2和Grx3的亲和力比较 | 第93-97页 |
| 3.7.1. Pull-down实验验证Fra2、Aft2和Grx3相互作用 | 第93-94页 |
| 3.7.2. SPR实验定量分析Fra2,Grx3~(Grx)和Aft2的亲和常数 | 第94-97页 |
| 第四章 讨论 | 第97-101页 |
| 4.1. Grx3作为GST酶参与氧化应激调控 | 第97页 |
| 4.2. Grx3协同Fra2来调节Aft2活性 | 第97-101页 |
| 第五章 结论 | 第101-103页 |
| 第六章 参考文献 | 第103-119页 |
| 第七章 附录 | 第119-125页 |
| 7.1. 引物设计 | 第119-120页 |
| 7.2. 大肠杆菌感受态的制备 | 第120页 |
| 7.3. 蛋白纯化原理简介 | 第120-122页 |
| 7.4. 蛋白晶体解析(HKL2000处理) | 第122-123页 |
| 7.5. 晶体数据分子置换MR | 第123-125页 |
| 第八章 致谢 | 第125-127页 |
| 第九章 攻读学位期间发表的学术论文 | 第127页 |
