| 摘要 | 第7-9页 |
| Abstract | 第9-11页 |
| 第一章 前言 | 第12-40页 |
| 1 锦鲤疱疹病毒病研究进展 | 第12-29页 |
| 1.1 鲤疱疹病毒 3 型病原学 | 第12-16页 |
| 1.2 锦鲤疱疹病毒病流行病学 | 第16-19页 |
| 1.3 临床症状 | 第19页 |
| 1.4 病理变化 | 第19页 |
| 1.5 诊断方法 | 第19-25页 |
| 1.6 预防与控制 | 第25-29页 |
| 2 鲤疱疹病毒 3 型分子生物学研究进展 | 第29-37页 |
| 2.1 基因组特点 | 第30页 |
| 2.2 开放阅读框 | 第30-34页 |
| 2.3 毒株的进化 | 第34-36页 |
| 2.4 鲤疱疹病毒 3 型与疱疹病毒的关系 | 第36-37页 |
| 3 原核表达系统 | 第37-38页 |
| 3.1 简介 | 第37页 |
| 3.2 原核表达系统在水产方面的应用 | 第37-38页 |
| 4 研究目的和意义 | 第38-40页 |
| 第二章 SYBR GREEN I CYHV-3 实时荧光定量 PCR 检测方法的建立 | 第40-56页 |
| 1 材料 | 第40-41页 |
| 1.1 病毒和细胞 | 第40页 |
| 1.2 主要试剂及耗材 | 第40页 |
| 1.3 主要仪器 | 第40-41页 |
| 2 方法 | 第41-47页 |
| 2.1 CyHV-3 的培养 | 第41页 |
| 2.2 CyHV-3DNA 的提取 | 第41页 |
| 2.3 PCR 阳性标准质粒的制备 | 第41-44页 |
| 2.4 标准品浓度的计算 | 第44-45页 |
| 2.5 重组质粒的稳定性检验 | 第45页 |
| 2.6 SYBR Green I 实时荧光定量 PCR 检测方法的建立 | 第45-47页 |
| 3 结果 | 第47-52页 |
| 3.1 PCR 扩增目的基因 | 第47-48页 |
| 3.2 重组克隆载体的鉴定 | 第48-49页 |
| 3.4 重组质粒浓度的测定 | 第49页 |
| 3.5 重组质粒的稳定性试验 | 第49页 |
| 3.6 荧光定量 PCR 循环条件和退火温度的优化 | 第49-50页 |
| 3.7 最佳引物浓度确定和融解曲线分析 | 第50页 |
| 3.8 标准曲线的生成 | 第50页 |
| 3.9 荧光定量 PCR 反应体系 | 第50-52页 |
| 4 讨论 | 第52-55页 |
| 4.1 实时荧光定量 PCR 标准品的构建 | 第52-53页 |
| 4.2 标准曲线的建立和回归方程的设定 | 第53页 |
| 4.3 实时荧光定量 PCR 引物设计 | 第53-54页 |
| 4.4 关于荧光域值的设定 | 第54页 |
| 4.5 关于实时荧光定量 PCR 假阳性和假阴性的问题 | 第54-55页 |
| 5 小结 | 第55-56页 |
| 第三章 锦鲤疱疹病毒病流行病学调查 | 第56-66页 |
| 1. 材料 | 第56页 |
| 2. 方法 | 第56-58页 |
| 2.1 样品采集及处理 | 第56页 |
| 2.2 样品基因组的提取 | 第56-57页 |
| 2.3 荧光定量 PCR 检测 | 第57页 |
| 2.4 普通 PCR 对样品的检测 | 第57页 |
| 2.5 国家行业标准对部分样品的检测 | 第57-58页 |
| 3 结果 | 第58-62页 |
| 3.1 流行病学调查结果 | 第58-61页 |
| 3.2 国家行业标准对部分样品的 PCR 检测结果 | 第61-62页 |
| 4 讨论 | 第62-64页 |
| 5 小结 | 第64-66页 |
| 第四章 DNA 疫苗在鲤鱼体内组织代谢与分布 | 第66-72页 |
| 1 材料 | 第66-67页 |
| 1.1 实验动物 | 第66页 |
| 1.2 病毒、细胞和质粒 | 第66页 |
| 1.3 主要试剂 | 第66页 |
| 1.4 主要仪器 | 第66-67页 |
| 2 方法 | 第67-69页 |
| 2.1 重组质粒的大量提取及纯化 | 第67-68页 |
| 2.2 重组质粒免疫鲤鱼 | 第68页 |
| 2.3 荧光定量 PCR 检测核酸疫苗的组织分布 | 第68-69页 |
| 3 结果 | 第69页 |
| 3.1 pIRES-ORF81 质粒的组织分布 | 第69页 |
| 4 讨论 | 第69-71页 |
| 4.1 DNA 疫苗在鱼类免疫中的应用 | 第69-70页 |
| 4.2 DNA 疫苗的免疫方法 | 第70-71页 |
| 4.3 DNA 疫苗在机体的分布与代谢 | 第71页 |
| 5 小结 | 第71-72页 |
| 第五章 CYHV-3 ORF108 的原核表达及免疫原性研究 | 第72-88页 |
| 1 材料 | 第72-73页 |
| 1.1 病毒和细胞 | 第72页 |
| 1.2 主要试剂及耗材 | 第72页 |
| 1.3 主要仪器 | 第72-73页 |
| 2 方法 | 第73-77页 |
| 2.1 引物设计 | 第73页 |
| 2.2 病毒基因组提取 | 第73页 |
| 2.3 ORF108 基因的扩增 | 第73页 |
| 2.4 PCR 产物的克隆及鉴定 | 第73页 |
| 2.5 重组表达质粒 pET32a-108 的构建 | 第73-74页 |
| 2.6 重组质粒的诱导表达 | 第74页 |
| 2.7 表达产物的 SDS-PAGE 分析 | 第74-75页 |
| 2.8 表达蛋白的回收与纯化 | 第75-76页 |
| 2.9 表达蛋白的多克隆抗体的制备及抗体反应原性鉴定 | 第76-77页 |
| 3 结果 | 第77-85页 |
| 3.1 ORF108 基因的 PCR 扩增 | 第77页 |
| 3.2 ORF108 基因克隆质粒的鉴定 | 第77-81页 |
| 3.3 重组表达质粒 pET32a-ORF108 的鉴定 | 第81-82页 |
| 3.4 表达产物的 SDS-PAGE 分析 | 第82-85页 |
| 3.5 表达蛋白的抗体的制备及抗体反应原性鉴定 | 第85页 |
| 4 讨论 | 第85-86页 |
| 4.1 关于 ORF108 蛋白 | 第85-86页 |
| 4.2 关于原核表达载体 | 第86页 |
| 4.3 关于免疫学检测方法 | 第86页 |
| 5 小结 | 第86-88页 |
| 结论 | 第88-90页 |
| 参考文献 | 第90-102页 |
| 作者简介 | 第102-104页 |
| 致谢 | 第104页 |
