| 摘要 | 第4-8页 |
| ABSTRACT | 第8-12页 |
| 英文缩略词表 | 第16-18页 |
| 前言 | 第18-22页 |
| 第一章 生殖支原体GlpK的甘油激酶活性研究 | 第22-48页 |
| 1.1 材料和试剂 | 第22-26页 |
| 1.1.1 质粒,菌株及动物 | 第22页 |
| 1.1.2 主要实验试剂 | 第22-24页 |
| 1.1.3 实验仪器设备 | 第24-26页 |
| 1.2 方法 | 第26-35页 |
| 1.2.1 Mg GlpK基因的优化与合成 | 第26页 |
| 1.2.2 Mg GlpK基因引物的设计与合成 | 第26页 |
| 1.2.3 Mg GlpK基因的PCR扩增及初步鉴定 | 第26-27页 |
| 1.2.4 Mg GlpK基因PCR扩增产物的纯化与回收 | 第27页 |
| 1.2.5 pGEX6p-1质粒和PCR纯化产物的双酶切及纯化回收 | 第27-28页 |
| 1.2.6 pGEX6p-1/GlpK重组质粒亚克隆连接 | 第28页 |
| 1.2.7 E.coli BL21感受态的制备 | 第28页 |
| 1.2.8 pGEX6p-1/GlpK重组质粒的转化 | 第28-29页 |
| 1.2.9 pGEX6p-1/GlpK重组质粒的PCR鉴定及测序 | 第29页 |
| 1.2.10 GST-GlpK融合蛋白的诱导表达 | 第29-30页 |
| 1.2.11 GST-GlpK融合蛋白的存在状态分析 | 第30页 |
| 1.2.12 GST-GlpK融合蛋白的纯化 | 第30页 |
| 1.2.13 GST-GlpK融合蛋白的Western blotting鉴定 | 第30-31页 |
| 1.2.14 GST-GlpK融合蛋白的小鼠免疫 | 第31页 |
| 1.2.15 抗GST-GlpK融合蛋白免疫血清特异性抗体的鉴定 | 第31-32页 |
| 1.2.16 ELISA检测GST-GlpK特异性抗体 | 第32页 |
| 1.2.17 GST-GlpK融合蛋白免疫血清的纯化 | 第32-33页 |
| 1.2.18 GlpK蛋白的纯化 | 第33页 |
| 1.2.19 纯化的GlpK蛋白的浓缩与储存 | 第33页 |
| 1.2.20 纯化的GlpK蛋白的浓度测定 | 第33-34页 |
| 1.2.21 GlpK蛋白的酶活性测定 | 第34-35页 |
| 1.3 结果 | 第35-45页 |
| 1.3.1 Mg GlpK基因的优化与合成 | 第35-38页 |
| 1.3.2 Mg GlpK基因的PCR扩增 | 第38-39页 |
| 1.3.3 pGEX6p-1/GlpK重组质粒的PCR鉴定和双酶切 | 第39页 |
| 1.3.4 GlpK基因测序及BLAST分析 | 第39页 |
| 1.3.5 pGEX6p-1/GlpK重组菌的诱导表达及鉴定 | 第39-40页 |
| 1.3.6 GST-GlpK融合蛋白的Western blotting鉴定 | 第40-41页 |
| 1.3.7 GST-GlpK融合蛋白的纯化及GST标签的切割 | 第41页 |
| 1.3.8 ELISA检测免疫血清特异性抗体 | 第41-42页 |
| 1.3.9 Western blotting鉴定免疫血清特异性抗体 | 第42页 |
| 1.3.10 GST-GlpK pAb的纯化 | 第42-43页 |
| 1.3.11 BCA法测定GlpK蛋白浓度 | 第43-44页 |
| 1.3.12 GlpK蛋白的甘油激酶活性 | 第44页 |
| 1.3.13 温度和pH对GlpK蛋白甘油激酶活性的影响 | 第44-45页 |
| 1.4 讨论 | 第45-48页 |
| 第二章 生殖支原体GlpO的细胞定位及酶活性研究 | 第48-76页 |
| 2.1 材料和试剂 | 第48-53页 |
| 2.1.1 质粒和菌株 | 第48页 |
| 2.1.2 主要实验试剂 | 第48-51页 |
| 2.1.3 仪器设备 | 第51-53页 |
| 2.2 方法 | 第53-63页 |
| 2.2.1 改良Difco PPLO液体培养基的配制 | 第53页 |
| 2.2.2 Mg的培养与传代 | 第53页 |
| 2.2.3 Mg GlpO基因的优化与合成 | 第53页 |
| 2.2.4 Mg GlpO基因及AA序列的生物信息学分析 | 第53-54页 |
| 2.2.5 Mg GlpO基因的引物设计与合成 | 第54页 |
| 2.2.6 Mg GlpO基因PCR扩增及初步鉴定 | 第54页 |
| 2.2.7 DNA片段的纯化与回收 | 第54-55页 |
| 2.2.8 pGEX6p-1质粒和PCR纯化产物的双酶切及纯化回收 | 第55页 |
| 2.2.9 pGEX6p-1/GlpO重组质粒亚克隆连接 | 第55-56页 |
| 2.2.10 E.coli BL21感受态的制备 | 第56页 |
| 2.2.11 pGEX6p-1/GlpO重组质粒的转化 | 第56页 |
| 2.2.12 pGEX6p-1/GlpO重组质粒的PCR鉴定及测序 | 第56-57页 |
| 2.2.13 GST-GlpO融合蛋白的诱导表达 | 第57页 |
| 2.2.14 GST-GlpO融合蛋白的存在状态分析 | 第57页 |
| 2.2.15 GST-GlpO融合蛋白的纯化 | 第57-58页 |
| 2.2.16 GST-GlpO融合蛋白的Western blotting鉴定 | 第58页 |
| 2.2.17 GST-GlpO融合蛋白的小鼠免疫 | 第58-59页 |
| 2.2.18 抗GST-GlpO融合蛋白免疫血清特异性抗体的鉴定 | 第59页 |
| 2.2.19 间接ELISA检测GST-GlpO特异性抗体 | 第59-60页 |
| 2.2.20 GST-GlpO融合蛋白免疫血清的纯化 | 第60页 |
| 2.2.21 GlpO蛋白的纯化 | 第60-61页 |
| 2.2.22 纯化的GlpO蛋白的浓缩与储存 | 第61页 |
| 2.2.23 纯化的GlpO蛋白的浓度测定 | 第61页 |
| 2.2.24 GlpO蛋白酶活性测定 | 第61-62页 |
| 2.2.25 Mg膜蛋白与胞浆蛋白的相分离 | 第62页 |
| 2.2.26 Western blotting鉴定GlpO蛋白的亚定位 | 第62-63页 |
| 2.3 结果 | 第63-73页 |
| 2.3.1 Mg GlpO基因的优化与合成 | 第63-65页 |
| 2.3.2 Mg GlpO蛋白的生物信息学分析 | 第65-66页 |
| 2.3.3 Mg GlpO基因的PCR扩增 | 第66-67页 |
| 2.3.4 pGEX6p-1/GlpO重组质粒的PCR鉴定和双酶切 | 第67-68页 |
| 2.3.5 GlpO基因测序及BLAST分析 | 第68页 |
| 2.3.6 pGEX6p-1/GlpO重组蛋白的诱导表达 | 第68页 |
| 2.3.7 GST-GlpO重组蛋白的Western blotting鉴定 | 第68-69页 |
| 2.3.8 GST-GlpO重组蛋白的纯化及GST标签的切割 | 第69-70页 |
| 2.3.9 ELISA检测免疫血清特异性抗体 | 第70页 |
| 2.3.10 Western blotting鉴定免疫血清特异性抗体 | 第70页 |
| 2.3.11 GST-GlpO pAb的纯化 | 第70-71页 |
| 2.3.12 GlpO蛋白的酶活性 | 第71-72页 |
| 2.3.13 GlpO蛋白在Mg中的细胞定位 | 第72-73页 |
| 2.4 讨论 | 第73-76页 |
| 第三章 GlpK和GlpO对细胞毒性的调控作用研究 | 第76-93页 |
| 3.1 材料和试剂 | 第76-80页 |
| 3.1.1 质粒和菌株 | 第76页 |
| 3.1.2 主要实验试剂 | 第76-79页 |
| 3.1.3 仪器设备 | 第79-80页 |
| 3.2 方法 | 第80-84页 |
| 3.2.1 改良Difco PPLO液体培养基的配制 | 第80页 |
| 3.2.2 Mg的培养与传代 | 第80页 |
| 3.2.3 MTnTetM438转座子的电转化 | 第80-81页 |
| 3.2.4 Mg突变株的筛选和鉴定 | 第81页 |
| 3.2.5 碳源利用试验 | 第81-82页 |
| 3.2.6 碳源对GlpK或GlpO的表达的影响 | 第82页 |
| 3.2.7 H_2O_2的测定 | 第82页 |
| 3.2.8 细胞毒性试验 | 第82页 |
| 3.2.9 氧化应激试验 | 第82-84页 |
| 3.3 结果 | 第84-90页 |
| 3.3.1 Mg突变株的筛选和鉴定 | 第84-85页 |
| 3.3.2 碳源利用试验 | 第85页 |
| 3.3.3 葡萄糖和甘油对GlpK或GlpO表达的影响 | 第85-86页 |
| 3.3.4 H_2O_2的产生及抑制实验 | 第86页 |
| 3.3.5 细胞毒性试验及抑制实验 | 第86-88页 |
| 3.3.6 胞内氧化应激试验及抑制实验 | 第88-90页 |
| 3.4 讨论 | 第90-93页 |
| 参考文献 | 第93-102页 |
| 综述 | 第102-122页 |
| 参考文献 | 第111-122页 |
| 攻读学位期间主要研究成果 | 第122-124页 |
| 致谢 | 第124页 |
