| 致谢 | 第5-7页 |
| 摘要 | 第7-9页 |
| ABSTRACT | 第9-10页 |
| 英文缩写词对应表 | 第11-16页 |
| 1 绪论 | 第16-34页 |
| 1.1 2,3,5-三甲基氢醌(TMHQ)简介 | 第16页 |
| 1.2 2,3,5-三甲基氢醌(TMHQ)合成 | 第16-22页 |
| 1.2.1 2,3,6-三甲基苯酚(TMP)氧化还原法 | 第17-19页 |
| 1.2.1.1 TMP法氧化反应研究进展 | 第17-19页 |
| 1.2.1.2 TMP法还原反应研究进展 | 第19页 |
| 1.2.2 异佛尔酮法 | 第19-21页 |
| 1.2.2.1 异佛尔酮的氧化 | 第20-21页 |
| 1.2.2.2 茶香酮重排酰化 | 第21页 |
| 1.2.3 TMHQ的生物合成 | 第21-22页 |
| 1.3 氧化还原酶 | 第22-30页 |
| 1.3.1 氧化还原酶简介 | 第22页 |
| 1.3.2 过氧化物酶 | 第22-24页 |
| 1.3.3 单加氧酶 | 第24-30页 |
| 1.3.3.1 P450_(BM3)简介 | 第24-25页 |
| 1.3.3.2 催化机制 | 第25-27页 |
| 1.3.3.3 关键氨基酸 | 第27-30页 |
| 1.4 酶分子改造 | 第30-32页 |
| 1.4.1 定向进化 | 第30-31页 |
| 1.4.2 半理性设计 | 第31页 |
| 1.4.3 理性设计 | 第31-32页 |
| 1.5 本课题研究的意义及内容 | 第32-34页 |
| 2 氧化还原酶库的构建及筛选 | 第34-55页 |
| 2.1 引言 | 第34页 |
| 2.2 实验材料与方法 | 第34-43页 |
| 2.2.0 菌株及质粒 | 第34-35页 |
| 2.2.1 试剂与工具酶 | 第35页 |
| 2.2.2 实验仪器设备 | 第35-36页 |
| 2.2.3 氧化还原酶的挖掘 | 第36页 |
| 2.2.3.1 数据库挖掘 | 第36页 |
| 2.2.3.2 文献挖掘 | 第36页 |
| 2.2.4 基因组的提取 | 第36-37页 |
| 2.2.5 大肠杆菌感受态的制备 | 第37-38页 |
| 2.2.6 目的基因的扩增及重组质粒的构建 | 第38-39页 |
| 2.2.7 重组子的鉴定 | 第39-40页 |
| 2.2.8 目标蛋白的表达 | 第40页 |
| 2.2.9 SDS-PAGE检测蛋白表达 | 第40-42页 |
| 2.2.10 氧化还原酶活性筛选 | 第42页 |
| 2.2.11 HRPC的复性 | 第42-43页 |
| 2.2.12 HRP C酶活检测 | 第43页 |
| 2.2.13 液相检测条件 | 第43页 |
| 2.3 实验结果与讨论 | 第43-53页 |
| 2.3.1 目的基因的克隆 | 第43-45页 |
| 2.3.2 目标蛋白的可溶性表达 | 第45-51页 |
| 2.3.2.1 HRP C的表达 | 第45-48页 |
| 2.3.2.2 26℃氧化还原酶的可溶性表达 | 第48-49页 |
| 2.3.2.3 16℃氧化还原酶的可溶性表达 | 第49-51页 |
| 2.3.3 氧化还原酶催化TMP活力筛选 | 第51-53页 |
| 2.3.3.1 复性HRP C的催化活性 | 第51-52页 |
| 2.3.3.2 可溶性表达氧化还原酶的催化活性 | 第52-53页 |
| 2.4 本章小结 | 第53-55页 |
| 3 P450_(BM3)催化2,3,6-三甲基苯酚氧化的反应条件优化 | 第55-69页 |
| 3.1 引言 | 第55页 |
| 3.2 实验材料 | 第55-56页 |
| 3.2.1 菌种 | 第55页 |
| 3.2.2 试剂 | 第55页 |
| 3.2.3 仪器 | 第55-56页 |
| 3.3 实验方法 | 第56-60页 |
| 3.3.1 P450_(BM3)重组蛋白的诱导表达 | 第56页 |
| 3.3.2 目标蛋白的纯化 | 第56-58页 |
| 3.3.3 蛋白浓度的测定 | 第58页 |
| 3.3.4 还原剂的选择 | 第58页 |
| 3.3.5 催化反应的条件优化 | 第58-60页 |
| 3.3.6 反应进程 | 第60页 |
| 3.4 实验结果与讨论 | 第60-67页 |
| 3.4.1 检测条件的优化 | 第60-61页 |
| 3.4.2 还原剂对TMHQ氧化反应的影响 | 第61-62页 |
| 3.4.3 辅酶对催化反应的影响 | 第62-63页 |
| 3.4.4 温度对催化反应的影响 | 第63页 |
| 3.4.5 pH对催化反应的影响 | 第63-64页 |
| 3.4.6 助溶剂对催化反应的影响 | 第64-65页 |
| 3.4.7 助溶剂浓度对催化反应的影响 | 第65页 |
| 3.4.8 底物浓度对催化反应的影响 | 第65-66页 |
| 3.4.9 金属离子对催化反应的影响 | 第66-67页 |
| 3.4.10 P450_(BM3)催化TMP生成TMHQ的反应进程 | 第67页 |
| 3.5 本章小结 | 第67-69页 |
| 4 氧化还原酶P450_(BM3)在大肠杆菌中的定向进化 | 第69-79页 |
| 4.1 引言 | 第69页 |
| 4.2 实验材料 | 第69-70页 |
| 4.2.1 菌株 | 第69页 |
| 4.2.2 试剂、试剂盒、工具酶 | 第69-70页 |
| 4.2.3 实验仪器设备 | 第70页 |
| 4.3 实验方法 | 第70-74页 |
| 4.3.1 突变文库的构建 | 第70-71页 |
| 4.3.2 突变文库的诱导表达 | 第71-72页 |
| 4.3.3 高通量筛选方法的构建 | 第72-73页 |
| 4.3.4 复筛 | 第73页 |
| 4.3.5 突变体蛋白的表达与纯化 | 第73页 |
| 4.3.6 动力学常数测定 | 第73-74页 |
| 4.3.7 分子对接 | 第74页 |
| 4.4 结果与讨论 | 第74-78页 |
| 4.4.1 突变文库的构建 | 第74-75页 |
| 4.4.2 高通量筛选方法构建 | 第75-76页 |
| 4.4.3 突变体蛋白的表达 | 第76页 |
| 4.4.4 P450_(BM3)和突变体催化TMP生成TMHQ | 第76-77页 |
| 4.4.5 分子对接 | 第77-78页 |
| 4.5 本章小结 | 第78-79页 |
| 5 结论与展望 | 第79-81页 |
| 5.1 结论 | 第79-80页 |
| 5.2 展望 | 第80-81页 |
| 参考文献 | 第81-90页 |
| 附录 | 第90-94页 |
