| 中文摘要 | 第4-5页 |
| Abstract | 第5-6页 |
| 第一章 引言 | 第13-21页 |
| 1.1 研究背景及意义 | 第13-14页 |
| 1.2 研究现状 | 第14-17页 |
| 1.2.1 尿酸酶的其本性质及其来源 | 第14-15页 |
| 1.2.2 尿酸酶的结构研究 | 第15-16页 |
| 1.2.3 尿酸酶应用研究进展 | 第16-17页 |
| 1.2.4 原核表达的优点 | 第17页 |
| 1.3 研究目的 | 第17-18页 |
| 1.4 研究内容与技术路线 | 第18-21页 |
| 1.4.1 研究内容 | 第18页 |
| 1.4.2 技术路线 | 第18-21页 |
| 第二章 人-狗嵌合尿酸酶的上游构建 | 第21-35页 |
| 2.1 材料与仪器 | 第21-24页 |
| 2.1.1 实验材料 | 第21-24页 |
| 2.1.1.1 菌株和质粒 | 第21页 |
| 2.1.1.2 主要试剂 | 第21-22页 |
| 2.1.1.3 主要仪器 | 第22-23页 |
| 2.1.1.4 主要试剂配制 | 第23-24页 |
| 2.2 实验方法 | 第24-30页 |
| 2.2.1 目的基因的获得 | 第24页 |
| 2.2.2 重组质粒pET3C-Uricase 的构建及鉴定 | 第24-27页 |
| 2.2.2.1 酶切及胶回收 | 第25页 |
| 2.2.2.2 连接反应 | 第25-26页 |
| 2.2.2.3 大肠杆菌感受态细胞的制备 | 第26页 |
| 2.2.2.4 连接产物的转化 | 第26页 |
| 2.2.2.5 阳性克隆的筛选及质粒的抽提 | 第26页 |
| 2.2.2.6 重组质粒的鉴定 | 第26-27页 |
| 2.2.2.7 基因序列的测定 | 第27页 |
| 2.2.3 重组尿酸酶在大肠杆菌中的表达 | 第27-28页 |
| 2.2.3.1 E.coli BL21（DE3）Star plysS 感受态的制备 | 第27-28页 |
| 2.2.3.2 重组质粒的转化及多拷贝重组子的筛选 | 第28页 |
| 2.2.3.3 重组尿酸酶摇瓶诱导表达 | 第28页 |
| 2.2.4 SDS-PAGE 凝胶电泳检测 | 第28-29页 |
| 2.2.4.1 样品的制备 | 第28页 |
| 2.2.4.2 凝胶的制备 | 第28-29页 |
| 2.2.5 酶活初步测定 | 第29-30页 |
| 2.2.5.1 样品的制备 | 第29页 |
| 2.2.5.2 测定方法 | 第29-30页 |
| 2.3 结果与分析 | 第30-33页 |
| 2.3.1 重组质粒pET3C- Uricase 的构建 | 第30页 |
| 2.3.2 DNA 测序结果 | 第30-32页 |
| 2.3.3 重组尿酸酶摇瓶诱导表达 | 第32页 |
| 2.3.4 表达形式的确定 | 第32-33页 |
| 2.4 本章小结 | 第33-35页 |
| 第三章 人-狗嵌合尿酸酶发酵研究 | 第35-43页 |
| 3.1 材料与仪器 | 第35-36页 |
| 3.1.1 实验材料 | 第35-36页 |
| 3.1.1.1 菌株 | 第35页 |
| 3.1.1.2 主要试剂 | 第35页 |
| 3.1.1.3 主要仪器 | 第35-36页 |
| 3.1.1.4 主要试剂的配制 | 第36页 |
| 3.2 实验方法 | 第36-37页 |
| 3.2.1 种子菌的活化 | 第36页 |
| 3.2.2 二级种子液 | 第36页 |
| 3.2.3 不同培养基对Uricase 表达量的影响 | 第36-37页 |
| 3.2.4 UHC 诱导表达及表达条件的优化 | 第37页 |
| 3.2.5 发酵检测方法 | 第37页 |
| 3.3 结果与分析 | 第37-40页 |
| 3.3.1 不同培养基对Uricase 表达量的影响 | 第37-38页 |
| 3.3.2 不同IPTG 浓度对蛋白表达的影响 | 第38页 |
| 3.3.3 温度对菌体生长及表达形式的影响 | 第38-39页 |
| 3.3.4 不同诱导时间对蛋白表达的影响 | 第39页 |
| 3.3.5 补料的作用 | 第39页 |
| 3.3.6 溶氧对Uricase 表达的影响 | 第39-40页 |
| 3.3.7 质粒的稳定性考察 | 第40页 |
| 3.4 讨论 | 第40-41页 |
| 3.5 本章小结 | 第41-43页 |
| 第四章 人-狗嵌合尿酸酶纯化工艺研究 | 第43-53页 |
| 4.1 材料与仪器 | 第43-44页 |
| 4.1.1 主要试剂 | 第43页 |
| 4.1.2 主要仪器 | 第43-44页 |
| 4.1.3 主要试剂的配制 | 第44页 |
| 4.2 破菌方法的研究 | 第44-45页 |
| 4.2.1 冻融超声破菌法 | 第44页 |
| 4.2.2 溶菌酶破菌法 | 第44-45页 |
| 4.3 目的蛋白溶解方法的研究 | 第45页 |
| 4.3.1 0.1mol/L 碳酸缓冲溶解法 | 第45页 |
| 4.3.2 0.2mol/L 碳酸缓冲溶解法 | 第45页 |
| 4.3.3 温度对Uricase 溶解的影响 | 第45页 |
| 4.4 目的蛋白粗纯化的研究 | 第45-46页 |
| 4.4.1 饱和硫酸铵沉淀试验方法 | 第45-46页 |
| 4.4.2 Phenyl Sepharose F.F.层析试验方法 | 第46页 |
| 4.5 目的蛋白精纯化的研究 | 第46-47页 |
| 4.5.1 Sephacryl S-300 HR.层析实验方法 | 第46-47页 |
| 4.6 纯化工艺过程质量控制方法 | 第47-49页 |
| 4.6.1 SDS-PAGE | 第47页 |
| 4.6.2 Lowry 法测蛋白质浓度 | 第47-48页 |
| 4.6.3 高效液相色谱法 | 第48页 |
| 4.6.4 酶活测定 | 第48-49页 |
| 4.7 结果与分析 | 第49-52页 |
| 4.7.1 破菌试验结果与分析 | 第49页 |
| 4.7.2 目的蛋白粗纯化的结果与分析 | 第49-52页 |
| 4.8 讨论 | 第52页 |
| 4.9 本章小结 | 第52-53页 |
| 第五章 人-狗嵌合尿酸酶的性质研究 | 第53-67页 |
| 5.1 材料与仪器 | 第53-55页 |
| 5.1.1 主要试剂 | 第53页 |
| 5.1.2 仪器 | 第53-54页 |
| 5.1.3 试剂配制 | 第54-55页 |
| 5.2 实验方法 | 第55-62页 |
| 5.2.1 理化性质研究 | 第55-59页 |
| 5.2.2 酶学性质研究 | 第59-62页 |
| 5.3 结果与讨论 | 第62-66页 |
| 5.3.1 尿酸酶的分子量结果与分析 | 第62页 |
| 5.3.2 尿酸酶等电点结果与分析 | 第62页 |
| 5.3.3 免疫印迹结果与分析 | 第62-63页 |
| 5.3.4 纯度测定检测结果与分析 | 第63页 |
| 5.3.5 紫外吸收特征结果与分析 | 第63页 |
| 5.3.6 pH 对尿酸酶酶活影响的结果与分析 | 第63-64页 |
| 5.3.7 温度对尿酸酶酶活影响的结果与分析 | 第64页 |
| 5.3.8 pH 对尿酸酶稳定性影响的结果与分析 | 第64-65页 |
| 5.3.9 温度对尿酸酶保存影响的结果与分析 | 第65页 |
| 5.3.10 尿酸酶的米氏常数结果与分析 | 第65-66页 |
| 5.4 本章小结 | 第66-67页 |
| 第六章 结论与展望 | 第67-69页 |
| 6.1 结论 | 第67页 |
| 6.2 本文的创新性 | 第67页 |
| 6.3 展望 | 第67-69页 |
| 致谢 | 第69-71页 |
| 参考文献 | 第71-73页 |
| 附录 | 第73-75页 |
| 个人简历、在学期间发表的学术论文及取得的研究成果 | 第75页 |
