| 第一部分 人超氣化物歧化K-胸腺素al在毕赤酵母中的表达、纯化与活性检测 | 第9-44页 |
| 摘要 | 第10-12页 |
| Abstract | 第12-14页 |
| 1 前言 | 第14-17页 |
| 1.1 胸腺素α1的生物学特性与应用 | 第14页 |
| 1.2 超氧化物歧化酶的特性 | 第14-15页 |
| 1.3 酵母系统表达蛋白的特点 | 第15页 |
| 1.4 立题背景和研究内容 | 第15-17页 |
| 2 材料和方法 | 第17-31页 |
| 2.1 材料 | 第17-20页 |
| 2.1.1 菌株 | 第17页 |
| 2.1.2 质粒 | 第17-18页 |
| 2.1.3 引物 | 第18页 |
| 2.1.4 主要试剂 | 第18页 |
| 2.1.5 主要仪器设备 | 第18-19页 |
| 2.1.6 培养基和常用溶液 | 第19-20页 |
| 2.2 方法 | 第20-31页 |
| 2.2.1 分子克隆实验技术 | 第20-24页 |
| 2.2.1.1 PCR | 第20-21页 |
| 2.2.1.2 酶切反应体系 | 第21-22页 |
| 2.2.1.3 连接反应 | 第22页 |
| 2.2.1.4 大肠杆菌感受态细胞的制备和转化 | 第22页 |
| 2.2.1.5 大肠杆菌转化子鉴定和测序 | 第22-23页 |
| 2.2.1.6 质粒DNA抽提 | 第23页 |
| 2.2.1.7 琼脂糖电泳DNA片段回收 | 第23页 |
| 2.2.1.8 保种 | 第23页 |
| 2.2.1.9 SDS-PAGE蛋白电泳 | 第23-24页 |
| 2.2.1.10 Ni-NTA亲和层析柱的重生 | 第24页 |
| 2.2.2 融合基因hSOD-(G_4S)_1-thyα1和hSOD-(G_4S)_2-thyα1的克隆 | 第24-25页 |
| 2.2.2.1 hSOD基因的克隆 | 第24-25页 |
| 2.2.2.2 融合基因hSOD-(G_4S)_1-thyα1和hSOD-(G_4S)_2-thyα1的克隆 | 第25页 |
| 2.2.3 毕赤酵母表达载体构建、工程菌筛选及融合蛋白表达纯化 | 第25-28页 |
| 2.2.3.1 毕赤酵母表达载体构建 | 第25-26页 |
| 2.2.3.2 毕赤酵母GS115感受态的制备及电转化 | 第26-27页 |
| 2.2.3.3 毕赤酵母转化子的筛选鉴定 | 第27页 |
| 2.2.3.4 重组蛋白的表达 | 第27-28页 |
| 2.2.3.5 表达产物的纯化 | 第28页 |
| 2.2.4 超氧化物歧化酶酶活测定 | 第28-29页 |
| 2.2.4.1 蛋白含量测定 | 第28页 |
| 2.2.4.2 超氧化物歧化酶酶活测定 | 第28-29页 |
| 2.2.5 胸腺素活性测定 | 第29-31页 |
| 3 结果 | 第31-37页 |
| 3.1 重组表达菌株的构建 | 第31页 |
| 3.2 重组蛋白的表达与纯化 | 第31-34页 |
| 3.3 重组蛋白的超氧化物歧化酶酶活测定 | 第34-35页 |
| 3.4 重组蛋白的胸腺素活性测定 | 第35-37页 |
| 4 讨论 | 第37-40页 |
| 4.1 融合蛋白活性分析 | 第37页 |
| 4.2 重组蛋白的潜在优势 | 第37页 |
| 4.3 毕赤酵母表达系统的优缺点 | 第37-38页 |
| 4.4 连接肽对融合蛋白活性的影响 | 第38-39页 |
| 4.5 蛋白发酵与纯化策略 | 第39-40页 |
| 5 结论 | 第40-41页 |
| 参考文献 | 第41-44页 |
| 第二部分 11家族木聚糖酶热稳定性突变体的鉴定 | 第44-75页 |
| 摘要 | 第45-47页 |
| Abstract | 第47-49页 |
| 1 前言 | 第49-51页 |
| 1.1 纤维素酶研究的重要性 | 第49页 |
| 1.2 木聚糖酶的改造 | 第49-50页 |
| 1.3 立题背景和研究内容 | 第50-51页 |
| 2 材料和方法 | 第51-58页 |
| 2.1 材料 | 第51-53页 |
| 2.1.1 菌株 | 第51页 |
| 2.1.2 质粒 | 第51页 |
| 2.1.3 主要试剂 | 第51页 |
| 2.1.4 主要仪器设备 | 第51页 |
| 2.1.5 培养基和常用溶液 | 第51-53页 |
| 2.2 方法 | 第53-58页 |
| 2.2.1 分子克隆实验技术 | 第53页 |
| 2.2.1.1 大肠杆菌感受态细胞的制备和转化 | 第53页 |
| 2.2.1.2 质粒抽提 | 第53页 |
| 2.2.1.3 保种 | 第53页 |
| 2.2.1.4 SDS-PAGE蛋白电泳 | 第53页 |
| 2.2.1.5 Ni-NTA亲和层析柱的重生 | 第53页 |
| 2.2.2 大肠杆菌蛋白诱导表达 | 第53页 |
| 2.2.3 重组蛋白的纯化 | 第53-54页 |
| 2.2.3.1 蛋白样品准备 | 第53-54页 |
| 2.2.3.2 Ni-NTA亲和层析纯化 | 第54页 |
| 2.2.4 酶活测定 | 第54-55页 |
| 2.2.4.1 蛋白含量测定 | 第54页 |
| 2.2.4.2 DNS法测定酶活 | 第54-55页 |
| 2.2.5 热稳定性试验 | 第55-56页 |
| 2.2.6 圆二色光谱测定蛋白的热稳定性 | 第56页 |
| 2.2.7 生物信息学分析 | 第56-58页 |
| 3 结果 | 第58-69页 |
| 3.1 11家族木聚糖酶热稳定性突变体的氨基酸序列 | 第58页 |
| 3.2 突变体蛋白的表达与纯化 | 第58-60页 |
| 3.3 热稳定性及热失活常数的测定 | 第60-62页 |
| 3.4 圆二色谱测定热变性曲线和Tm值 | 第62-66页 |
| 3.5 突变体的生物信息学结构分析与预测 | 第66-69页 |
| 3.5.1 11家族的木聚糖酶的结构分析 | 第66页 |
| 3.5.2 突变体的同源建模结构预测 | 第66-69页 |
| 4 讨论 | 第69-71页 |
| 4.1 获得突变体的策略分析 | 第69页 |
| 4.2 突变体蛋白结构分析 | 第69-71页 |
| 5 结论 | 第71-72页 |
| 参考文献 | 第72-75页 |
| 致谢 | 第75-77页 |
| 硕士期间发表论文 | 第77-78页 |
