| 摘要 | 第6-7页 |
| ABSTRACT | 第7-8页 |
| 文献综述 | 第15-40页 |
| 第一章 转基因动物研究技术概述 | 第15-28页 |
| 1.1 转基因技术的发展及方法 | 第15-25页 |
| 1.1.1 转基因技术的发展 | 第15页 |
| 1.1.2 转基因技术的方法 | 第15-25页 |
| 1.2 转基因动物的应用 | 第25-26页 |
| 1.2.1 动物抗病育种 | 第25页 |
| 1.2.2 人类疾病模型的建立 | 第25-26页 |
| 1.2.3 利用转基因动物产生药物 | 第26页 |
| 1.2.4 血液替代物的生产 | 第26页 |
| 1.2.5 异种器官移植 | 第26页 |
| 1.3 转基因技术的问题和未来 | 第26-28页 |
| 1.3.1 转基因技术的问题 | 第26-27页 |
| 1.3.2 转基因技术的展望 | 第27-28页 |
| 第二章 结核病和 HBD3 的研究进展 | 第28-40页 |
| 2.1 病原及基因组 | 第28-29页 |
| 2.2 牛结核病 | 第29-31页 |
| 2.2.1 病原及基因组 | 第29页 |
| 2.2.2 流行病学调查 | 第29-30页 |
| 2.2.3 牛结核病的症状 | 第30页 |
| 2.2.4 结核的诊断 | 第30-31页 |
| 2.2.5 疫苗和治疗 | 第31页 |
| 2.3 其他动物的结核 | 第31-32页 |
| 2.3.1 猪的结核 | 第31-32页 |
| 2.3.2 山羊的结核病 | 第32页 |
| 2.3.3 绵羊的结核病 | 第32页 |
| 2.3.4 狗的结核病 | 第32页 |
| 2.4 人防御素的发现 | 第32-35页 |
| 2.4.1 人β防御素 3（human β defensin 3）的发现 | 第33-34页 |
| 2.4.2 人β防御素 3 的结构 | 第34页 |
| 2.4.3 人防御素的抗菌机制 | 第34页 |
| 2.4.4 人防御素抗菌谱分析 | 第34-35页 |
| 2.4.5 HBD3 对于结核杆菌的抑制作用 | 第35页 |
| 2.5 Muc1 研究进展 | 第35-40页 |
| 2.5.1 Muc 1 在肺中的表达 | 第36页 |
| 2.5.2 Muc1 的结构 | 第36-37页 |
| 2.5.3 Muc1 降低了呼吸系统的炎性反应 | 第37-38页 |
| 2.5.4 Muc1 表达水平的调节 | 第38-39页 |
| 2.5.5 Muc1 表达水平上调的机制 | 第39-40页 |
| 实验部分 | 第40-95页 |
| 第三章 人β防御素 3 的原核表达及其抑菌活性分析 | 第40-48页 |
| 3.1 实验材料 | 第40-41页 |
| 3.1.1 菌株及质粒 | 第40页 |
| 3.1.2 主要试剂 | 第40-41页 |
| 3.2 方法 | 第41-42页 |
| 3.2.1 HBD3 合成 | 第41页 |
| 3.2.2 融合表达载体构建 | 第41页 |
| 3.2.3 融合蛋白的诱导表达 | 第41页 |
| 3.2.4 超声裂解法获得可溶性融合蛋白 | 第41页 |
| 3.2.5 纯化重组蛋白 | 第41-42页 |
| 3.2.6 纯化产物的 Western blot 鉴定 | 第42页 |
| 3.2.7 重组蛋白生物活性鉴定 | 第42页 |
| 3.3 结果 | 第42-46页 |
| 3.3.1 pGEX-5X-HBD3 重组表达载体鉴定 | 第42-43页 |
| 3.3.2 融合蛋白诱导表达 | 第43页 |
| 3.3.3 目的蛋白纯化 | 第43页 |
| 3.3.4 GST 与 HBD3 分离 | 第43-44页 |
| 3.3.5 重组 HBD3 的 Western blot 鉴定 | 第44页 |
| 3.3.6 重组蛋白的生物活性鉴定 | 第44-46页 |
| 3.4 讨论 | 第46-47页 |
| 3.5 小结 | 第47-48页 |
| 第四章 HBD3 对结核杆菌的抑制作用验证 | 第48-54页 |
| 4.1 材料 | 第48页 |
| 4.1.1 细菌及培养基 | 第48页 |
| 4.1.2 细胞系和培养基 | 第48页 |
| 4.1.3 主要试剂 | 第48页 |
| 4.2 方法 | 第48-49页 |
| 4.2.1 结核杆菌的培养 | 第48页 |
| 4.2.2 A549 和 RAW264.7 细胞的培养 | 第48-49页 |
| 4.2.3 HBD3 对结核杆菌最小抑菌浓度的确定 | 第49页 |
| 4.2.4 细菌的感染和染色 | 第49页 |
| 4.2.5 HBD3 抗菌浓度的间接验证 | 第49页 |
| 4.2.6 感染后细胞的免疫荧光染色 | 第49页 |
| 4.3 结果 | 第49-52页 |
| 4.3.1 HBD3 最小抑菌浓度 MIC 的确定 | 第49-50页 |
| 4.3.2 HBD3 处理后的结核杆菌对巨噬细胞凋亡的影响 | 第50页 |
| 4.3.3 HBD3 处理后的结核杆菌对肺上皮细胞凋亡的影响 | 第50-51页 |
| 4.3.4 结核杆菌对细胞的侵染染色 | 第51-52页 |
| 4.3.5 结核杆菌侵染细胞时造成的细胞中防御素免疫荧光分析 | 第52页 |
| 4.4 讨论 | 第52-53页 |
| 4.5 小结 | 第53-54页 |
| 第五章 牛 Muc1 的分布及其启动子扩增和效率验证 | 第54-62页 |
| 5.1 材料 | 第54页 |
| 5.1.1 牛组织 | 第54页 |
| 5.1.2 菌株和质粒 | 第54页 |
| 5.1.3 酶类及其他相关试剂 | 第54页 |
| 5.1.4 主要仪器及耗材 | 第54页 |
| 5.2 方法 | 第54-59页 |
| 5.2.1 MUC1 基因引物设计 | 第54页 |
| 5.2.2 Trizol 提总 RNA | 第54-55页 |
| 5.2.3 反转录反应 | 第55页 |
| 5.2.4 Real Time PCR 反应 | 第55-56页 |
| 5.2.5 MUC1 启动子引物设计 | 第56页 |
| 5.2.6 基因组 DNA 提取 | 第56-57页 |
| 5.2.7 PCR 扩增 | 第57页 |
| 5.2.8 提取重组质粒 | 第57页 |
| 5.2.9 pEGFP-N1-MUC1p 真核表达载体的构建及鉴定 | 第57页 |
| 5.2.10 细胞转染及转染后鉴定 | 第57-59页 |
| 5.3 结果 | 第59-60页 |
| 5.3.1 牛的 Muc1 蛋白在不同组织中的分布 | 第59页 |
| 5.3.2 牛 Muc1 启动子扩增及检测载体构建 | 第59页 |
| 5.3.3 pEGFP-muc1-N1 载体在牛肺泡上皮细胞和 293 细胞中的表达 | 第59-60页 |
| 5.3.4 牛 Muc1 启动子和 cmv 启动子启动效率的比较 | 第60页 |
| 5.4 讨论 | 第60-61页 |
| 5.5 小结 | 第61-62页 |
| 第六章 靶细胞牛肺 II 型上皮永生化细胞系的建立 | 第62-76页 |
| 6.1 材料 | 第62-64页 |
| 6.1.1 动物材料 | 第62-63页 |
| 6.1.2 主要试剂 | 第63页 |
| 6.1.3 所用引物 | 第63-64页 |
| 6.2 方法 | 第64-67页 |
| 6.2.1 pCI-neo-hTERT 质粒的提取与鉴定 | 第64页 |
| 6.2.2 AECsⅡ的培养与鉴定 | 第64-65页 |
| 6.2.3 AECsⅡ的转染与筛选 | 第65-66页 |
| 6.2.4 永生化细胞系的后期鉴定 | 第66-67页 |
| 6.2.5 数据分析 | 第67页 |
| 6.3 结果 | 第67-73页 |
| 6.3.1 pCI-neo-hTERT 质粒酶切鉴定与纯度和浓度检测 | 第67-68页 |
| 6.3.2 牛肺泡 II 型上皮细胞的分离及鉴定 | 第68-69页 |
| 6.3.3 转染后获得的 HTERT-AECs II 型细胞生长性能鉴定 | 第69-70页 |
| 6.3.4 永生化细胞系的端粒酶活性分析 | 第70-71页 |
| 6.3.5 永生化细胞系 Htert-AEC II 的生理特性分析 | 第71-72页 |
| 6.3.6 永生化细胞系对结核杆菌作用的验证 | 第72-73页 |
| 6.4 讨论 | 第73-74页 |
| 6.5 小结 | 第74-76页 |
| 第七章 表达载体构建及其抗菌性验证 | 第76-84页 |
| 7.1 材料 | 第76页 |
| 7.1.1 牛组织 | 第76页 |
| 7.1.2 人防御素基因扩增 | 第76页 |
| 7.1.3 带 loxp 的骨架载体 | 第76页 |
| 7.1.4 其他试剂 | 第76页 |
| 7.2 方法 | 第76-77页 |
| 7.2.1 牛组织 DNA 的扩增 | 第76页 |
| 7.2.2 表达载体构建 | 第76-77页 |
| 7.2.3 细胞的分离及转染 | 第77页 |
| 7.2.4 Elisa 检测培养液中的 HBD3 含量 | 第77页 |
| 7.2.5 western blot 检测细胞中 HBD3 含量 | 第77页 |
| 7.2.6 细胞中荷菌数的分析 | 第77页 |
| 7.2.7 转基因细胞和非转基因细胞在结核杆菌侵染时死亡率和凋亡率分析 | 第77页 |
| 7.3 结果 | 第77-82页 |
| 7.3.1 表达载体的构建 | 第77-78页 |
| 7.3.2 A549 细胞的单克隆获得及其抗菌性验证 | 第78页 |
| 7.3.3 牛肺 II 型上皮细胞转染效率的验证 | 第78-79页 |
| 7.3.4 转基因的牛肺 II 型上皮细胞抗菌性检测 | 第79-80页 |
| 7.3.5 结核杆菌侵染转基因 A549 细胞的死亡率和凋亡率分析 | 第80-81页 |
| 7.3.6 结核杆菌侵染转基因牛肺 II 型上皮细胞的死亡率和凋亡率分析 | 第81-82页 |
| 7.4 讨论 | 第82页 |
| 7.5 小结 | 第82-84页 |
| 第八章 转 HBD3 基因成纤维细胞系的建立及转基因牛生产 | 第84-95页 |
| 8.1 材料 | 第84-85页 |
| 8.1.1 实验材料 | 第84页 |
| 8.1.2 主要试剂 | 第84页 |
| 8.1.3 引物 | 第84-85页 |
| 8.2 方法 | 第85-86页 |
| 8.2.1 表达载体的大量提取及线性化 | 第85页 |
| 8.2.2 转基因单克隆成纤维细胞的获得 | 第85页 |
| 8.2.3 转基因单克隆细胞载体骨架完整性分析 | 第85页 |
| 8.2.4 单克隆细胞生长能力鉴定 | 第85页 |
| 8.2.5 单克隆细胞生长周期鉴定 | 第85-86页 |
| 8.2.6 单克隆细胞染色体核型分析 | 第86页 |
| 8.2.7 单克隆细胞拷贝数分析 | 第86页 |
| 8.2.8 插入位点分析 | 第86页 |
| 8.2.9 转基因克隆陪的制备成熟 | 第86页 |
| 8.2.10 转基因牛生产及鉴定 | 第86页 |
| 8.2.11 组织切片比较分析 | 第86页 |
| 8.2.12 转基因牛的抗病性检测 | 第86页 |
| 8.3 结果 | 第86-93页 |
| 8.3.1 转基因单克隆成纤维细胞的获得 | 第86-87页 |
| 8.3.2 细胞中插入载体的完整性分析 | 第87页 |
| 8.3.3 BFF 单克隆细胞的拷贝数分析 | 第87-88页 |
| 8.3.4 单克隆细胞的核型分析 | 第88-89页 |
| 8.3.5 单拷贝的 BFF 单克隆细胞生长特性分析 | 第89页 |
| 8.3.6 转基因核移植胚胎体外发育分析 | 第89-90页 |
| 8.3.7 转基因牛的生产及检测 | 第90-91页 |
| 8.3.8 转基因牛的脏器发育状况比较 | 第91-92页 |
| 8.3.9 转基因牛抗结核能力的检测 | 第92-93页 |
| 8.4 讨论 | 第93-94页 |
| 8.5 小结 | 第94-95页 |
| 全文结论 | 第95-96页 |
| 创新之处和进一步研究的课题 | 第96-97页 |
| 参考文献 | 第97-116页 |
| 附录 | 第116-121页 |
| 缩略词 | 第121-123页 |
| 致谢 | 第123-124页 |
| 个人简介 | 第124页 |
