| 中文摘要 | 第7-9页 |
| Abstract | 第9-11页 |
| 缩略语表 | 第12-14页 |
| 第一章 文献综述 | 第14-28页 |
| 1.1 弓形虫简述 | 第14-15页 |
| 1.2 弓形虫的致病机制 | 第15-20页 |
| 1.2.1 弓形虫的入侵机制 | 第15-17页 |
| 1.2.2 弓形虫对宿主细胞的调节机制 | 第17-19页 |
| 1.2.3 弓形虫的毒力因子 | 第19-20页 |
| 1.3 我国弓形虫病的流行状况 | 第20-21页 |
| 1.4 弓形虫转基因技术的研究 | 第21-26页 |
| 1.5 弓形虫疫苗的研究 | 第26-28页 |
| 第二章 TALEN介导的弓形虫RON2的失活及RON2 DNA疫苗的研究 | 第28-47页 |
| 2.1 目的与意义 | 第28页 |
| 2.2 材料方法 | 第28-36页 |
| 2.2.1 实验动物 | 第28页 |
| 2.2.2 虫株及细胞 | 第28-29页 |
| 2.2.3 载体、质粒 | 第29页 |
| 2.2.4 主要试剂与仪器 | 第29页 |
| 2.2.5 主要溶液的配制 | 第29-31页 |
| 2.2.6 TALEN靶点设计及引物设计 | 第31-32页 |
| 2.2.7 TALEN质粒构建方法 | 第32页 |
| 2.2.8 TALEN技术介导的弓形虫的转染与阳性筛选 | 第32-33页 |
| 2.2.9 RON2真核表达质粒的构建 | 第33页 |
| 2.2.10 pcDNA3.1-RON2-1/2/3 的体外转染验证 | 第33-34页 |
| 2.2.11 pcDNA3.1-RON2-1/2/3 DNA疫苗的体内诱导实验 | 第34-36页 |
| 2.3 结果 | 第36-44页 |
| 2.3.1 TALEN敲除质粒的构建及鉴定 | 第36-38页 |
| 2.3.2 RON2敲除的筛选验证 | 第38-40页 |
| 2.3.3 RON2作为DNA疫苗候选分子的验证 | 第40-44页 |
| 2.4 讨论 | 第44-46页 |
| 2.4.1 TALEN技术对弓形虫基因的调控 | 第44-45页 |
| 2.4.2 AMA1-RON2运动连接的功能 | 第45页 |
| 2.4.3 pcDNA3.1-RON2-1/2/3 DNA疫苗的免疫效果评价 | 第45-46页 |
| 2.5 小结 | 第46-47页 |
| 第三章 CRISPR介导的弓形虫毒力基因的敲除 | 第47-75页 |
| 3.1 目的与意义 | 第47页 |
| 3.2 材料与方法 | 第47-59页 |
| 3.2.1 实验动物 | 第47页 |
| 3.2.2 虫株及细胞 | 第47-48页 |
| 3.2.3 载体、质粒与引物 | 第48-50页 |
| 3.2.4 主要试剂与仪器 | 第50-51页 |
| 3.2.5 主要溶液的配制 | 第51-53页 |
| 3.2.6 敲除质粒的构建 | 第53-54页 |
| 3.2.7 GRA7、ROP17多克隆抗体的制备 | 第54-56页 |
| 3.2.8 HFF细胞的传代培养 | 第56页 |
| 3.2.9 弓形虫速殖子的体外培养 | 第56页 |
| 3.2.10 弓形虫速殖子的转染与筛选 | 第56-57页 |
| 3.2.11 单克隆虫株的鉴定 | 第57-58页 |
| 3.2.12 敲除虫株的生长特性实验 | 第58-59页 |
| 3.3 结果与分析 | 第59-70页 |
| 3.3.1 敲除质粒的构建 | 第59-62页 |
| 3.3.2 GRA7，ROP17多克隆抗体的制备 | 第62-64页 |
| 3.3.3 单克隆虫株的筛选与鉴定 | 第64-68页 |
| 3.3.4 GRA7，ROP17，ROP18缺失对虫体生物学特性的影响 | 第68-70页 |
| 3.4 讨论 | 第70-74页 |
| 3.4.1 CRISPR-Cas9系统介导的弓形虫基因敲除 | 第70-71页 |
| 3.4.2 质粒构建方法的优化 | 第71-72页 |
| 3.4.3 弓形虫的转染与筛选 | 第72页 |
| 3.4.4 GRA7，ROP17，ROP18敲除虫株的生物学特性分析 | 第72-74页 |
| 3.5 小结 | 第74-75页 |
| 第四章 CRISPR系统在弓形虫基因表达调控中的应用 | 第75-85页 |
| 4.1 目的与意义 | 第75页 |
| 4.2 材料与方法 | 第75-78页 |
| 4.2.1 质粒、载体 | 第75-76页 |
| 4.2.2 稳定表达RFP弓形虫的构建 | 第76-77页 |
| 4.2.3 CRISPR系统质粒的改造 | 第77-78页 |
| 4.2.4 pCRISPR-dCas9对SAG1启动子的抑制作用 | 第78页 |
| 4.3 结果与分析 | 第78-82页 |
| 4.3.1 稳定表达RFP的T.g△UPRT-RFP虫株的构建 | 第78-79页 |
| 4.3.2 CRISPR系统质粒的改造 | 第79-81页 |
| 4.3.3 CRISPR-dCas9系统的抑制作用 | 第81-82页 |
| 4.4 讨论 | 第82-84页 |
| 4.4.1 稳定表达RFP虫株的构建 | 第82-83页 |
| 4.4.2 CRISPR-dCas9转录抑制系统的构建 | 第83页 |
| 4.4.3 CRISPR-dCas9系统对弓形虫SAG1启动子的转录抑制 | 第83-84页 |
| 4.5 小结 | 第84-85页 |
| 第五章 结论 | 第85-86页 |
| 参考文献 | 第86-96页 |
| 附录 1 | 第96-105页 |
| 1.附-图 | 第96-101页 |
| 2.附-表 | 第101页 |
| 3.附-方法 | 第101-105页 |
| 方法 1：点突变法质粒构建 | 第101页 |
| 方法 2：同源重组法质粒构建 | 第101-103页 |
| 方法 3：基因组DNA的提取及PCR鉴定 | 第103页 |
| 方法 4：目的基因片段的回收与纯化 | 第103页 |
| 方法 5：大肠杆菌DH5α 感受态细胞的制备 | 第103-104页 |
| 方法 6：质粒或连接产物的转化 | 第104页 |
| 方法 7：阳性克隆的筛选与菌液PCR鉴定 | 第104-105页 |
| 附录 2 | 第105-106页 |
| 致谢 | 第106-108页 |
