| 摘要 | 第6-8页 |
| Abstract | 第8-9页 |
| 第一章 引言 | 第15-23页 |
| 1.1 兔出血症和兔出血症病毒概述 | 第15页 |
| 1.2 病毒样颗粒疫苗概述 | 第15-19页 |
| 1.2.1 常用表达系统 | 第16-17页 |
| 1.2.2 病毒样颗粒的应用进展 | 第17-19页 |
| 1.2.3 存在问题及应用前景 | 第19页 |
| 1.3 兔出血症疫苗研究现状 | 第19-21页 |
| 1.3.1 灭活疫苗 | 第19页 |
| 1.3.2 亚单位疫苗 | 第19-21页 |
| 1.4 兔出血症诊断方法的研究现状 | 第21-22页 |
| 1.5 基于单克隆抗体的双抗夹心ELISA诊断方法 | 第22页 |
| 1.6 本研究的目的及意义 | 第22-23页 |
| 第二章 兔出血症病毒VP60蛋白的表达和鉴定 | 第23-31页 |
| 2.1 材料 | 第23-24页 |
| 2.1.1 质粒、菌株和抗体 | 第23页 |
| 2.1.2 主要实验试剂 | 第23-24页 |
| 2.1.3 主要仪器 | 第24页 |
| 2.2 实验方法 | 第24-27页 |
| 2.2.1 VP60基因的扩增 | 第24页 |
| 2.2.2 pSMK-VP60原核表达重组质粒的构建和鉴定 | 第24-26页 |
| 2.2.3 重组VP60蛋白的表达和纯化 | 第26-27页 |
| 2.2.4 重组VP60蛋白的纯化 | 第27页 |
| 2.2.5 SDS-PAGE和Western blotting检测 | 第27页 |
| 2.3 结果 | 第27-30页 |
| 2.3.1 VP60基因的扩增 | 第27-28页 |
| 2.3.2 重组质粒pSMK-VP60在DH5α 中的PCR鉴定 | 第28-29页 |
| 2.3.3 重组VP60蛋白的表达 | 第29页 |
| 2.3.4 重组VP60蛋白的反应原性鉴定 | 第29页 |
| 2.3.5 重组VP60蛋白的可溶性分析及纯化 | 第29-30页 |
| 2.4 讨论 | 第30-31页 |
| 第三章 VP60蛋白VLPs的制备和免疫学性检测 | 第31-39页 |
| 3.1 材料与方法 | 第31-32页 |
| 3.1.1 试验动物，灭活疫苗，兔抗RHDV阳性血清、阴性血清 | 第31页 |
| 3.1.2 主要实验试剂 | 第31页 |
| 3.1.3 主要仪器 | 第31-32页 |
| 3.2 实验方法 | 第32-34页 |
| 3.2.1 VLPs的制备 | 第32页 |
| 3.2.2 重组VP60蛋白的酶切效果与VLPs形成的鉴定 | 第32页 |
| 3.2.3 SPF兔免疫试验和攻毒保护实验 | 第32-34页 |
| 3.3 结果 | 第34-37页 |
| 3.3.1 体外制备VLPs的鉴定结果 | 第34-35页 |
| 3.3.2 VP60特异性抗体水平的检测 | 第35-36页 |
| 3.3.3 淋巴细胞增殖试验检测 | 第36页 |
| 3.3.4 白介素-4 细胞因子检测 | 第36-37页 |
| 3.3.5 干扰素-γ 水平的检测 | 第37页 |
| 3.3.6 动物保护试验 | 第37页 |
| 3.4 讨论 | 第37-39页 |
| 第四章 RHDV VP60蛋白单克隆抗体的制备与鉴定 | 第39-44页 |
| 4.1 材料与方法 | 第39页 |
| 4.1.1 细胞和实验动物 | 第39页 |
| 4.1.2 主要试剂 | 第39页 |
| 4.2 实验方法 | 第39-41页 |
| 4.2.1 动物免疫 | 第39页 |
| 4.2.2 间接ELISA方法检测小鼠血清中抗VP60蛋白效价 | 第39-40页 |
| 4.2.3 细胞融合 | 第40页 |
| 4.2.4 有限稀释、克隆阳性杂交瘤细胞 | 第40页 |
| 4.2.5 腹水的制备 | 第40页 |
| 4.2.6 单克隆抗体亚型的测定 | 第40-41页 |
| 4.2.7 Western blotting分析单克隆抗体生物学特性 | 第41页 |
| 4.2.8 间接免疫荧光分析单克隆抗体生物学特性 | 第41页 |
| 4.3 结果 | 第41-43页 |
| 4.3.1 融合前小鼠血清抗VP60蛋白抗体效价测定 | 第41页 |
| 4.3.2 阳性杂交瘤细胞的筛选 | 第41-42页 |
| 4.3.3 单克隆抗体亚型的鉴定 | 第42页 |
| 4.3.4 Western blotting方法鉴定单克隆抗体与VP60蛋白的互相作用 | 第42-43页 |
| 4.3.5 间接免疫荧光方法鉴定单克隆抗体与VP60蛋白的互相作用 | 第43页 |
| 4.4 讨论 | 第43-44页 |
| 第五章 双抗夹心ELISA检测RHDV方法的初步的建立 | 第44-52页 |
| 5.1 材料和方法 | 第44-46页 |
| 5.1.1 抗体及样品 | 第44页 |
| 5.1.2 试剂 | 第44-45页 |
| 5.1.3 样品的处理 | 第45页 |
| 5.1.4 抗体配对实验 | 第45页 |
| 5.1.5 确定捕获抗体和检测抗体最佳工作浓度 | 第45页 |
| 5.1.6 确定最适包被条件 | 第45页 |
| 5.1.7 确定最佳封闭剂 | 第45页 |
| 5.1.8 确定最佳封闭条件 | 第45-46页 |
| 5.1.9 确定最佳酶标抗体稀释液 | 第46页 |
| 5.1.10 确定阴阳性标准 | 第46页 |
| 5.1.11 特异性试验 | 第46页 |
| 5.1.12 临床样品检测试验 | 第46页 |
| 5.2 结果 | 第46-50页 |
| 5.2.1 抗体配对试验 | 第46页 |
| 5.2.2 双抗夹心ELISA法的建立 | 第46-48页 |
| 5.2.3 最适包被条件的确定 | 第48页 |
| 5.2.4 最适封闭剂的确定 | 第48页 |
| 5.2.5 最适封闭条件的确定 | 第48页 |
| 5.2.6 最适酶标抗体稀释液的确定 | 第48-49页 |
| 5.2.7 临界值的确定 | 第49页 |
| 5.2.8 试验的特异性 | 第49-50页 |
| 5.2.9 临床样品检测结果分析 | 第50页 |
| 5.3 讨论 | 第50-52页 |
| 第六章 全文结论 | 第52-53页 |
| 参考文献 | 第53-60页 |
| 致谢 | 第60-61页 |
| 作者简介 | 第61页 |
