| 摘要 | 第9-12页 |
| Abstract | 第12-14页 |
| 缩略语表(Abbreviation) | 第15-18页 |
| 第一章 文献综述 | 第18-43页 |
| 1.1 猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）流行病学和危害 | 第18-23页 |
| 1.1.1 临床症状 | 第18-19页 |
| 1.1.2 PRRSV流行病学 | 第19-22页 |
| 1.1.3 PRRSV防治措施 | 第22-23页 |
| 1.2 PRRSV分子生物学特征 | 第23-25页 |
| 1.2.1 PRRSV病毒粒子结构 | 第23页 |
| 1.2.2 PRRSV基因组结构 | 第23-25页 |
| 1.3 PRRSV非结构蛋白研究进展 | 第25-29页 |
| 1.4 PRRSV非结构蛋白参与宿主先天性免疫调控 | 第29-30页 |
| 1.5 PRRSV结构蛋白（GP5和N）研究进展 | 第30-32页 |
| 1.6 尼多病毒目病毒内切核糖核酸酶（Nendo U）研究进展 | 第32-38页 |
| 1.6.1 NendoU与RNA底物作用机制 | 第33-35页 |
| 1.6.2 NendoU具有与RNase A类似的催化机制 | 第35-36页 |
| 1.6.3 锰离子对NendoU功能的影响 | 第36页 |
| 1.6.4 冠状病毒nsp15以六聚体形式发挥功能 | 第36-37页 |
| 1.6.5 NendoU在尼多病毒目病毒复制过程中的功能尚不明确 | 第37-38页 |
| 1.7 X射线晶体学简介 | 第38-43页 |
| 1.7.1 蛋白的表达与纯化 | 第39-40页 |
| 1.7.2 结晶 | 第40-41页 |
| 1.7.3 衍射数据收集与结构解析 | 第41-43页 |
| 第二章 目的与意义 | 第43-44页 |
| 第三章 材料方法 | 第44-61页 |
| 3.1 实验材料 | 第44-48页 |
| 3.1.1 毒株和细胞 | 第44页 |
| 3.1.2 菌株和质粒 | 第44页 |
| 3.1.3 工具酶及主要试剂 | 第44-45页 |
| 3.1.4 培养基与抗生素及其配制 | 第45页 |
| 3.1.5 质粒构建缓冲液配制 | 第45-46页 |
| 3.1.6 蛋白纯化缓冲液配制 | 第46页 |
| 3.1.7 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）缓冲液及试剂 | 第46-47页 |
| 3.1.8.Western Blot缓冲液及试剂 | 第47页 |
| 3.1.9 主要实验仪器及设备 | 第47页 |
| 3.1.10 分子生物学及蛋白晶体结构分析软件 | 第47-48页 |
| 3.2 实验方法 | 第48-61页 |
| 3.2.1 病料采集与处理 | 第48页 |
| 3.2.1.1 样品采集 | 第48页 |
| 3.2.1.2 样品保存与处理 | 第48页 |
| 3.2.2 PRRSV RT-PCR检测方法 | 第48-49页 |
| 3.2.2.1 病毒RNA提取 | 第48页 |
| 3.2.2.2 RT-PCR反应体系 | 第48-49页 |
| 3.2.2.3 RT-PCR扩增程序 | 第49页 |
| 3.2.2.4 电泳 | 第49页 |
| 3.2.2.5 结果判定 | 第49页 |
| 3.2.3 nsp2、orf5和orf7基因扩增 | 第49-52页 |
| 3.2.3.1 nsp2、orf5和orf7基因引物序列 | 第49页 |
| 3.2.3.2 PCR扩增条件 | 第49-50页 |
| 3.2.3.3 PCR产物的回收 | 第50页 |
| 3.2.3.4 外源DNA片段与质粒载体的连接反应 | 第50-51页 |
| 3.2.3.5 重组质粒或连接产物转化 | 第51页 |
| 3.2.3.6 质粒的小量制备 | 第51-52页 |
| 3.2.4 原核和真核表达质粒构建 | 第52-53页 |
| 3.2.4.1 引物 | 第52-53页 |
| 3.2.4.2 PRRSV nsp11野生型及突变体基因的扩增体系 | 第53页 |
| 3.2.4.3 限制性内切酶酶切反应 | 第53页 |
| 3.2.4.4 PCR产物（或酶切产物）的回收 | 第53页 |
| 3.2.4.5 外源DNA片段与质粒载体的连接反应 | 第53页 |
| 3.2.4.6 重组质粒或连接产物转化 | 第53页 |
| 3.2.5 重组质粒的制备与鉴定 | 第53-54页 |
| 3.2.5.1 质粒的小量制备 | 第53-54页 |
| 3.2.5.2 质粒的大量制备 | 第54页 |
| 3.2.5.3 质粒DNA的定量 | 第54页 |
| 3.2.6 蛋白表达与纯化 | 第54-55页 |
| 3.2.6.1 蛋白小量表达 | 第54-55页 |
| 3.2.6.2 蛋白大量表达与纯化 | 第55页 |
| 3.2.7 PRRSV nsp11硒代甲硫氨酸衍生物的表达和纯化 | 第55-56页 |
| 3.2.8 结晶条件的筛选 | 第56-57页 |
| 3.2.8.1 结晶条件初筛 | 第56页 |
| 3.2.8.2 结晶条件优化 | 第56页 |
| 3.2.8.3 晶体冻存 | 第56-57页 |
| 3.2.9 PRRSV nsp11及Se-Met nsp11（K173A）晶体的衍射数据收集 | 第57页 |
| 3.2.10 PRRSV nsp11及Se-Met nsp11（K173A）晶体结构解析 | 第57页 |
| 3.2.11 分子筛层析实验 | 第57-58页 |
| 3.2.12 分析超速离心实验 | 第58页 |
| 3.2.13 PRRSV nsp11内切核糖核酸酶（Nendo U）活性测定 | 第58页 |
| 3.2.14 PRRSV nsp11细胞毒性实验 | 第58-59页 |
| 3.2.15 双荧光素酶报告基因检测 | 第59页 |
| 3.2.16 Western Blot实验 | 第59-60页 |
| 3.2.17 序列分析 | 第60页 |
| 3.2.18 统计学方法 | 第60-61页 |
| 第四章 结果与分析 | 第61-99页 |
| 4.1 湖北地区PRRSV流行病学及分子变异情况分析 | 第61-72页 |
| 4.1.1 湖北地区PRRSV流行病学分析 | 第61-62页 |
| 4.1.2 nsp2基因分子变异分析 | 第62-66页 |
| 4.1.3 orf5基因分子变异分析 | 第66-69页 |
| 4.1.4 orf7基因分子变异分析 | 第69-72页 |
| 4.2 PRRSV内切核糖核酸酶nsp11结构和功能研究 | 第72-99页 |
| 4.2.1 PRRSV nsp11克隆、表达与纯化 | 第72-75页 |
| 4.2.2 PRRSV nsp11结晶条件初筛 | 第75-76页 |
| 4.2.3 PRRSV nsp11结晶条件优化 | 第76-77页 |
| 4.2.4 PRRSV nsp11（wild-type，native）晶体的数据收集与分析 | 第77-78页 |
| 4.2.5 Se-Met nsp11（K173A）结晶、数据收集与结构解析 | 第78-79页 |
| 4.2.6 PRRSV nsp11（wild-type，native）结构解析和优化 | 第79-80页 |
| 4.2.7 PRRSV nsp11晶体结构分析 | 第80-82页 |
| 4.2.8 PRRSV nsp11二聚体界面关键氨基酸表位突变研究 | 第82-86页 |
| 4.2.9 PRRSV nsp11野生型和突变体蛋白AUC分析 | 第86-87页 |
| 4.2.10 PRRSV nsp11功能性二聚体结构分析 | 第87-89页 |
| 4.2.11 动脉炎病毒和冠状病毒NendoU结构域氨基酸序列同源性分析 | 第89-91页 |
| 4.2.12 PRRSV nsp11与冠状病毒nsp15结构同源性分析 | 第91-92页 |
| 4.2.13 PRRSV nsp11 NendoU关键催化表位的突变研究 | 第92-95页 |
| 4.2.14 PRRSV nsp11对HEK293T细胞潜在细胞毒性分析 | 第95-97页 |
| 4.2.15 PRRSV nsp11对IFN-β 启动子活性的影响 | 第97-99页 |
| 第五章 讨论 | 第99-105页 |
| 5.1 湖北地区PRRSV分子变异情况分析 | 第99-101页 |
| 5.2 PRRSV内切核糖核酸酶nsp11发挥功能的结构基础分析 | 第101-105页 |
| 5.2.1 PRRSV nsp11以二聚体行使功能的结构基础 | 第101-102页 |
| 5.2.2 突变体S74A、F76A和R153A破坏nsp11稳定二聚体状态的结构基础 | 第102页 |
| 5.2.3 PRRSV nsp11内切核糖核酸酶的作用机制 | 第102-103页 |
| 5.2.4 PRRSV nsp11潜在的细胞毒性可能抑制了IFN-β 启动子的激活 | 第103-105页 |
| 第六章 结论 | 第105-106页 |
| 参考文献 | 第106-123页 |
| 附录 | 第123-124页 |
| 发表论文 | 第124-125页 |
| 致谢 | 第125-126页 |
