| 摘要 | 第4-7页 |
| ABSTRACT | 第7-11页 |
| 英文缩写说明 | 第12-18页 |
| 第一章 前言 | 第18-43页 |
| 1.1 植物病原细菌概述 | 第18-19页 |
| 1.2 黄单胞菌属概述 | 第19-23页 |
| 1.2.1 黄单胞菌属简介 | 第19-20页 |
| 1.2.2 黄单胞菌属的致病因子 | 第20-22页 |
| 1.2.3 黄单胞菌属致病系统 | 第22-23页 |
| 1.3 细菌分泌系统概述 | 第23-29页 |
| 1.3.1 Ⅰ型分泌系统 | 第24-25页 |
| 1.3.2 Ⅱ型分泌系统 | 第25页 |
| 1.3.3 Ⅲ型分泌系统 | 第25-26页 |
| 1.3.4 Ⅳ型分泌系统 | 第26页 |
| 1.3.5 Ⅴ型分泌系统 | 第26-27页 |
| 1.3.6 Ⅵ型分泌系统 | 第27页 |
| 1.3.7 Ⅶ型分泌系统 | 第27-28页 |
| 1.3.8 Sec分泌蛋白转运系统 | 第28页 |
| 1.3.9 Tat蛋白转运系统 | 第28-29页 |
| 1.4 细菌细胞壁概述 | 第29-33页 |
| 1.5 细菌肽聚糖裂解酶的概述 | 第33-35页 |
| 1.5.1 裂解性糖基转移酶的概述 | 第34页 |
| 1.5.2 肽聚糖内切酶的概述 | 第34页 |
| 1.5.3 N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶的概述 | 第34-35页 |
| 1.6 LytM家族的研究进展 | 第35-37页 |
| 1.6.1 NlpD脂蛋白的研究进展 | 第36页 |
| 1.6.2 EnvC蛋白的研究进展 | 第36-37页 |
| 1.7 肽聚糖裂解酶影响分泌系统的研究进展 | 第37-39页 |
| 1.8 十字花科黑腐病菌概述 | 第39-40页 |
| 1.9 十字花科黑腐病菌重要致病基因的研究进展 | 第40-42页 |
| 1.10 研究的目的和意义 | 第42-43页 |
| 第二章 材料和方法 | 第43-63页 |
| 2.1 菌株 | 第43-45页 |
| 2.2 质粒 | 第45-46页 |
| 2.3 菌株的培养条件和方法 | 第46-47页 |
| 2.4 总DNA的提取 | 第47-48页 |
| 2.5 质粒的提取 | 第48页 |
| 2.6 PCR反应 | 第48-50页 |
| 2.7 DNA的纯化 | 第50页 |
| 2.8 琼脂糖凝胶电泳 | 第50-51页 |
| 2.9 酶切反应 | 第51页 |
| 2.10 连接反应 | 第51页 |
| 2.11 电转化感受态的制作 | 第51-52页 |
| 2.12 转化 | 第52页 |
| 2.13 阳性克隆的验证 | 第52-53页 |
| 2.13.1 菌裂解PCR验证 | 第52-53页 |
| 2.13.2 酶切验证 | 第53页 |
| 2.14 三亲本接合 | 第53-54页 |
| 2.15 点突变构建策略和方法 | 第54-55页 |
| 2.16 致病性的检测 | 第55页 |
| 2.17 过敏反应的检测 | 第55-56页 |
| 2.17.1 定性过敏反应的检测 | 第55页 |
| 2.17.2 定量过敏反应的检测 | 第55-56页 |
| 2.18 5'RACE确定转录起始位点 | 第56页 |
| 2.19 显微镜观察 | 第56页 |
| 2.20 胞外酶的检测 | 第56-57页 |
| 2.20.1 胞外蛋白酶、纤维素酶、淀粉酶的平板检测 | 第56页 |
| 2.20.2 胞外蛋白酶、纤维素酶、淀粉酶的定量检测 | 第56-57页 |
| 2.21 胞外多糖的检测 | 第57页 |
| 2.22 运动性的检测 | 第57页 |
| 2.23 生物膜的检测 | 第57页 |
| 2.24 蛋白的表达 | 第57-58页 |
| 2.25 蛋白的纯化(6×His标签) | 第58页 |
| 2.26 肽聚糖的提取 | 第58页 |
| 2.27 肽聚糖与Remazol brilliant blue(RBB)标记 | 第58-59页 |
| 2.28 肽聚糖结合试验 | 第59页 |
| 2.29 肽聚糖降解试验 | 第59页 |
| 2.30 SDS-PAGE凝胶电泳 | 第59-60页 |
| 2.31 蛋白定量 | 第60页 |
| 2.32 Western blotting | 第60-61页 |
| 2.32.1 试剂耗材的准备 | 第60页 |
| 2.32.2 所需溶液 | 第60页 |
| 2.32.3 具体操作 | 第60-61页 |
| 2.33 细菌亚细胞定位蛋白的提取 | 第61-62页 |
| 2.33.1 细菌总蛋白的提取 | 第61页 |
| 2.33.2 细菌外膜蛋白和内膜蛋白的提取 | 第61-62页 |
| 2.33.3 细菌周质蛋白的提取 | 第62页 |
| 2.33.4 细菌胞外蛋白的提取 | 第62页 |
| 2.34 GUS酶活的测定 | 第62-63页 |
| 第三章 Xcc编码N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶基因突变体及互补菌株的构建 | 第63-72页 |
| 3.1 引言 | 第63页 |
| 3.2 生物信息学分析Xcc 8004中的N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶基因 | 第63-65页 |
| 3.3 amiD和ampD缺失突变体的构建 | 第65-67页 |
| 3.4 amiC相关突变体和互补菌株的构建 | 第67-71页 |
| 3.5 小结 | 第71-72页 |
| 第四章 Xcc的N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶基因对细胞分裂和致病性等的影响分析 | 第72-78页 |
| 4.1 引言 | 第72页 |
| 4.2 AmiC1是Xcc细胞分裂所必需的,AmiC2起一定的作用 | 第72-73页 |
| 4.3 AmiC1影响Xcc的致病性 | 第73-74页 |
| 4.4 AmiC1影响Xcc在非寄主上的HR | 第74-75页 |
| 4.5 AmiC1、AmiC2不影响胞外酶但AmiC1影响EPS产量 | 第75-76页 |
| 4.6 AmiC1影响游动性 | 第76-77页 |
| 4.7 小结 | 第77-78页 |
| 第五章 Xcc的N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶AmiC1需要潜在激活子的激活 | 第78-84页 |
| 5.1 引言 | 第78页 |
| 5.2 AmiC1的E335D点突变互补分析 | 第78-81页 |
| 5.3 带6个组氨酸且去掉信号肽区的AmiC蛋白表达菌株的构建 | 第81-82页 |
| 5.4 体外检测His_6-AmiC1_(LN32)具有微弱的降解肽聚糖的活性 | 第82-83页 |
| 5.5 小结 | 第83-84页 |
| 第六章 Xcc LytM家族蛋白NlpD和EnvC对细胞分裂和致病性等的影响分析 | 第84-112页 |
| 6.1 引言 | 第84页 |
| 6.2 LytM家族的生物信息学分析 | 第84-88页 |
| 6.3 从突变体库中获得含有LytM结构域基因的突变体 | 第88-89页 |
| 6.4 LytM结构域的突变体中nlpD和envC突变体影响细胞分裂 | 第89页 |
| 6.5 LytM结构域的突变体中nlpD突变体显著影响致病 | 第89-90页 |
| 6.6 生物信息学分析Xcc 8004中的EnvC和NlpD | 第90-95页 |
| 6.6.1 生物信息学分析Xcc 8004中的EnvC | 第90-92页 |
| 6.6.2 生物信息学分析Xcc 8004中的N1pD | 第92-95页 |
| 6.6.3 Xcc 8004的nlpD基因转录起始位点的确定以及启动子分析 | 第95页 |
| 6.7 Xcc 8004中envC、nlpD缺失突变体和互补菌株的构建 | 第95-101页 |
| 6.7.1 envC缺失突变体和互补菌株的构建 | 第95-99页 |
| 6.7.2 nlpD缺失突变体和互补菌株的构建 | 第99-101页 |
| 6.8 envC和nlpD的突变表型分析 | 第101-111页 |
| 6.8.1 envC和nlpD缺失突变体在NYG和MMX上的生长 | 第101-102页 |
| 6.8.2 envC和nlpD缺失突变体影响细胞分裂 | 第102-103页 |
| 6.8.3 nlpD缺失突变体显著影响致病性 | 第103-104页 |
| 6.8.4 nlpD缺失突变体显著影响HR | 第104-106页 |
| 6.8.5 envC缺失突变体不影响HR | 第106-107页 |
| 6.8.6 EnvC和NlpD不影响Ⅱ型胞外酶,但NlpD影响EPS的合成 | 第107页 |
| 6.8.7 envC和nlpD缺失突变体影响游动性 | 第107-108页 |
| 6.8.8 nlpD缺失突变体影响细胞聚集 | 第108-109页 |
| 6.8.9 nlpD缺失突变体对Zn~(2+)敏感 | 第109-110页 |
| 6.8.10 nlpD缺失突变体对pH敏感 | 第110-111页 |
| 6.9 小结 | 第111-112页 |
| 第七章 Xcc通过NlpD激活AmiC1影响细胞分裂和致病性 | 第112-121页 |
| 7.1 引言 | 第112页 |
| 7.2 Xcc中NlpD的亚细胞定位 | 第112-115页 |
| 7.2.1 Xcc 8004在基因组上NlpD融合3×Flag标签的菌株构建 | 第112-114页 |
| 7.2.2 Xcc的NlpD分布在细胞质、周质和外膜 | 第114-115页 |
| 7.3 带6个组氨酸标签且去掉信号肽区的NlpD和EnvC蛋白的表达纯化 | 第115页 |
| 7.4 His_6-NlpDLN22能在体外结合肽聚糖 | 第115-116页 |
| 7.5 His_6-NlpDN22能在体外增强HiS6-AmiC1_(LN32)降解肽聚糖的活性 | 第116-117页 |
| 7.6 AmiC1及其激活子NlpD影响致病性的机制研究 | 第117-119页 |
| 7.6.1 NlpD/EnvC/AmiC不影响Ⅲ型分泌系统hrp基因的表达 | 第117-118页 |
| 7.6.2 NlpD/AmiC1影响Ⅲ型效应物XC3176的分泌 | 第118-119页 |
| 7.7 小结 | 第119-121页 |
| 第八章 结论与讨论 | 第121-125页 |
| 8.1 Xcc的AmiC/NlpD/EnvC参与细胞分裂 | 第121-122页 |
| 8.2 Xcc的AmiC1/NlpD参与致病性 | 第122-123页 |
| 8.3 Xcc的AmiC1降解肽聚糖的活性需要LytM家族调控蛋白NlpD的激活 | 第123页 |
| 8.4 AmiC1/NlpD影响Xcc的Ⅲ型分泌系统,但不影响Ⅱ分泌系统 | 第123-125页 |
| 参考文献 | 第125-140页 |
| 致谢 | 第140-142页 |
| 攻读博士学位期间发表论文情况 | 第142页 |
