| 摘要 | 第3-4页 |
| Abstract | 第4-5页 |
| 第一章 文献综述 | 第10-16页 |
| 1 疥螨病危害 | 第10页 |
| 2 疥螨抗原与诊断方法研究进展 | 第10-13页 |
| 2.1 疥螨抗原基因研究进展 | 第10-11页 |
| 2.2 诊断 | 第11-13页 |
| 2.2.1 病原诊断 | 第11-12页 |
| 2.2.2 聚合酶链反应(PCR) | 第12页 |
| 2.2.3 酶联免疫吸附试验(ELISA) | 第12-13页 |
| 2.2.3.1 天然虫体抗原检测抗体 | 第12页 |
| 2.2.3.2 重组抗原检测抗体 | 第12-13页 |
| 3 丝切蛋白(cofilin)与寄生虫 | 第13-15页 |
| 4 展望 | 第15页 |
| 5 选题的目的意义 | 第15-16页 |
| 第二章 疥螨丝切蛋白基因的克隆表达、荧光免疫组化及重组抗原间接ELISA检测方法的建立 | 第16-47页 |
| 引言 | 第16页 |
| 1 材料与方法 | 第16-31页 |
| 1.1 试验材料 | 第16-19页 |
| 1.1.1 试验样品 | 第16-17页 |
| 1.1.2 主要试剂 | 第17页 |
| 1.1.3 菌株及质粒载体 | 第17页 |
| 1.1.4 主要仪器设备 | 第17页 |
| 1.1.5 主要溶液的配制 | 第17-19页 |
| 1.1.6 主要生物信息数据库和计算机软件 | 第19页 |
| 1.2 试验方法 | 第19-31页 |
| 1.2.1 兔疥螨的采集 | 第19-20页 |
| 1.2.2 疥螨总RNA的提取 | 第20页 |
| 1.2.3 疥螨丝切蛋白基因的克隆 | 第20-23页 |
| 1.2.3.1 引物设计及合成 | 第20页 |
| 1.2.3.2 丝切蛋白基因的PCR扩增 | 第20-21页 |
| 1.2.3.3 PCR产物的回收 | 第21-22页 |
| 1.2.3.4 基因的连接及转化 | 第22页 |
| 1.2.3.5 菌落PCR鉴定 | 第22页 |
| 1.2.3.6 目的基因序列的测定 | 第22-23页 |
| 1.2.4 疥螨丝切蛋白基因的原核表达载体构建 | 第23-25页 |
| 1.2.4.1 表达引物的设计 | 第23页 |
| 1.2.4.2 表达基因的亚克隆 | 第23页 |
| 1.2.4.3 重组T克隆质粒的构建 | 第23页 |
| 1.2.4.4 疥螨丝切蛋白的T克隆质粒的提取与酶切 | 第23-24页 |
| 1.2.4.5 pET32a(+)质粒的提取与酶切 | 第24页 |
| 1.2.4.6 疥螨丝切蛋白质粒与pET32a(+)质粒的连接与转化 | 第24-25页 |
| 1.2.4.7 重组表达质粒pET32a(+)-cofilin的PCR、双酶切、序列鉴定 | 第25页 |
| 1.2.5 重组表达质粒pET32a(+)-cofilin在大肠杆菌中的诱导表达 | 第25-27页 |
| 1.2.5.1 疥螨丝切重组蛋白的初步诱导表达 | 第25页 |
| 1.2.5.2 SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳分析 | 第25-26页 |
| 1.2.5.3 诱导剂IPTG浓度的优化 | 第26页 |
| 1.2.5.4 诱导表达时间的优化 | 第26页 |
| 1.2.5.5 诱导表达温度的优化 | 第26-27页 |
| 1.2.5.6 表达蛋白的可溶性分析 | 第27页 |
| 1.2.6 重组蛋白的纯化 | 第27页 |
| 1.2.7 疥螨重组丝切蛋白免疫印迹(western-blot)检测 | 第27-28页 |
| 1.2.8 免疫荧光组织化学 | 第28-30页 |
| 1.2.8.1 蛋白乳剂苗制备 | 第28页 |
| 1.2.8.2 免疫实验兔获得高免血清 | 第28-29页 |
| 1.2.8.3 间接ELISA检测高免血清的效价 | 第29页 |
| 1.2.8.4 纯化特异性疥螨cofilin-IgG | 第29页 |
| 1.2.8.5 免疫荧光组织化学试验 | 第29-30页 |
| 1.2.9 间接ELISA方法建立 | 第30-31页 |
| 1.2.9.1 抗原包被浓度与血清稀释比的优化 | 第30页 |
| 1.2.9.2 酶标二抗工作浓度的优化 | 第30页 |
| 1.2.9.3 封闭液的选择 | 第30页 |
| 1.2.9.4 丝切重组蛋白间接ELISA程序的确定 | 第30页 |
| 1.2.9.5 间接ELISA阴阳性判断标准的确定 | 第30-31页 |
| 1.2.9.6 交叉反应检测 | 第31页 |
| 1.2.9.7 重复性检测 | 第31页 |
| 1.2.9.8 特异性和敏感性 | 第31页 |
| 2 结果 | 第31-44页 |
| 2.1 兔疥螨丝切蛋白的克隆 | 第31-35页 |
| 2.1.1 兔疥螨丝切蛋白的PCR扩增 | 第31-32页 |
| 2.1.2 T克隆重组质粒的PCR鉴定 | 第32页 |
| 2.1.3 T克隆重组质粒的序列鉴定 | 第32-33页 |
| 2.1.4 重组质粒的序列分析 | 第33页 |
| 2.1.5 疥螨丝切蛋白的生物信息学分析 | 第33-35页 |
| 2.1.5.1 丝切蛋白基因的碱基组成分析 | 第33页 |
| 2.1.5.2 氨基酸翻译和蛋白质组分分析 | 第33-34页 |
| 2.1.5.3 重组丝切蛋白的信号肽位点预测 | 第34-35页 |
| 2.1.5.4 蛋白质跨膜区预测 | 第35页 |
| 2.2 疥螨丝切蛋白基因的亚克隆 | 第35-36页 |
| 2.2.1 加酶切位点引物的PCR扩增 | 第35-36页 |
| 2.2.2 重组质粒pET32a(+)-cofilin的PCR与酶切鉴定 | 第36页 |
| 2.3 疥螨丝切蛋白基因重组表达质粒的构建、鉴定与诱导表达 | 第36-37页 |
| 2.3.1 重组表达质粒的双酶切和序列鉴定 | 第36-37页 |
| 2.3.2 重组表达质粒的诱导表达 | 第37页 |
| 2.4 重组质粒表达条件的优化 | 第37-38页 |
| 2.4.1 IPTG浓度的优化 | 第37-38页 |
| 2.4.2 诱导时间的优化 | 第38页 |
| 2.4.3 诱导温度的优化 | 第38页 |
| 2.5 重组丝切蛋白可溶性分析 | 第38-39页 |
| 2.6 重组蛋白纯化结果 | 第39页 |
| 2.7 融合蛋白表达产物免疫印迹结果 | 第39-40页 |
| 2.8 免疫荧光组织化学 | 第40页 |
| 2.9 重组丝切蛋白间接ELISA方法建立 | 第40-44页 |
| 2.9.1 抗原与血清最佳工作浓度的确定 | 第40-41页 |
| 2.9.2 酶标二抗最佳稀释度的确定 | 第41页 |
| 2.9.3 封闭液的选择 | 第41-42页 |
| 2.9.4 丝切重组蛋白间接ELISA程序的确定 | 第42页 |
| 2.9.5 间接ELISA阴阳性判断标准的确定 | 第42页 |
| 2.9.6 交叉反应检测结果 | 第42-43页 |
| 2.9.7 重复性检测结果 | 第43页 |
| 2.9.7.1 批内重复性检测结果 | 第43页 |
| 2.9.7.2 批间重复性检测结果 | 第43页 |
| 2.9.8 特异性和敏感性 | 第43-44页 |
| 3 讨论 | 第44-47页 |
| 3.1 疥螨丝切蛋白基本特征 | 第44页 |
| 3.2 诊断价值分析 | 第44-47页 |
| 第三章 结论和创新点 | 第47-48页 |
| 1 结论 | 第47页 |
| 2 创新点 | 第47-48页 |
| 参考文献 | 第48-54页 |
| 致谢 | 第54页 |
