| 摘要 | 第3-6页 |
| Abstract | 第6-8页 |
| 第一章 文献综述 | 第16-33页 |
| 1. 免疫抑制性受体的研究进展 | 第16-22页 |
| 1.1 PD-1及其配体的发现和结构鉴定 | 第16-17页 |
| 1.2 PD-1/PD-Ls分子传导通路 | 第17-18页 |
| 1.3 PD-1和PD-Ls的表达和调节 | 第18-19页 |
| 1.4 PD-1/PD-L1通路与病毒感染 | 第19-20页 |
| 1.5 免疫抑制性受体CTLA-4和LAG-3的研究进展 | 第20-21页 |
| 1.6 猪免疫抑制性受体的研究进展 | 第21-22页 |
| 2. 猪瘟致病机制研究进展 | 第22-27页 |
| 2.1 猪瘟 | 第22-23页 |
| 2.2 猪瘟病毒 | 第23-25页 |
| 2.3 CSFV免疫致病机制 | 第25-27页 |
| 3. 断奶仔猪多系统衰竭综合征致病机制研究进展 | 第27-31页 |
| 3.1 断奶仔猪多系统衰竭综合征 | 第27-28页 |
| 3.2 PMWS病原 | 第28-29页 |
| 3.3 PMWS免疫致病机制 | 第29-31页 |
| 4. 本课题研究目的与意义 | 第31-33页 |
| 第二章 猪感染CSFV后PD-1及其配体转录水平研究 | 第33-54页 |
| 1. 引言 | 第33页 |
| 2. 材料与方法 | 第33-43页 |
| 2.1 病毒、细胞和试验动物 | 第33页 |
| 2.2 主要生物学试剂 | 第33-34页 |
| 2.3 主要溶液配制 | 第34页 |
| 2.4 主要仪器 | 第34-35页 |
| 2.5 CSFV的繁殖及TCID_(50)的测定 | 第35-36页 |
| 2.5.1 CSFV繁殖 | 第35-36页 |
| 2.5.2 CSFV TCID_(50)测定 | 第36页 |
| 2.6 实时荧光定量PCR(qPCR)检测目的基因mRNA方法的建立 | 第36-39页 |
| 2.6.1 引物设计与合成 | 第36页 |
| 2.6.2 PBMC分离 | 第36-37页 |
| 2.6.3 PBMCs中总RNA抽提 | 第37-38页 |
| 2.6.4 反转录合成cDNA | 第38页 |
| 2.6.5 qPCR阳性标准品制备 | 第38-39页 |
| 2.6.6 qPCR标准曲线建立 | 第39页 |
| 2.7 Taqman探针qPCR检测CSFV方法的建立 | 第39-41页 |
| 2.7.1 引物与探针的设计与合成 | 第39页 |
| 2.7.2 Taqman探针qPCR阳性标准品准备 | 第39-40页 |
| 2.7.3 Taqman探针qPCR标准曲线建立 | 第40页 |
| 2.7.4 敏感性试验 | 第40-41页 |
| 2.7.5 特异性试验 | 第41页 |
| 2.8 检测CSFV感染过程中PD-1与其配体转录水平及免疫效应变化 | 第41-43页 |
| 2.8.1 人工感染CSFV | 第41页 |
| 2.8.2 qPCR检测PD-1、PD-L1、PD-L2及其细胞因子IL-2和IL-10 | 第41页 |
| 2.8.3 qPCR结果分析 | 第41-42页 |
| 2.8.4 检测血浆中CSFV载量 | 第42页 |
| 2.8.5 T细胞增殖能力检测 | 第42-43页 |
| 3. 结果与分析 | 第43-51页 |
| 3.1 CSFV鉴定与TCID_(50)的测定 | 第43-44页 |
| 3.2 qPCR检测PD-1、PD-L1、PD-L2及细胞因子IL-2、IL-10标准曲线的建立 | 第44-46页 |
| 3.3 Taqman探针qPCR检测CSFV方法的建立 | 第46-47页 |
| 3.3.1 标准曲线的建立 | 第46页 |
| 3.3.2 敏感性 | 第46页 |
| 3.3.3 特异性 | 第46-47页 |
| 3.4 人工感染CSFV | 第47-48页 |
| 3.5 感染CSFV过程中PD-1、PD-L1和PD-L2 mRNA转录变化 | 第48-49页 |
| 3.6 感染CSFV过程中IL-2和IL-10 mRNA转录变化和T细胞增殖能力的检测 | 第49-51页 |
| 3.7 血浆中CSFV载量 | 第51页 |
| 4. 讨论 | 第51-53页 |
| 4.1 PD-1及其配体PD-L1和PD-L2表达 | 第51页 |
| 4.2 细胞因子IL-2和IL-10表达及T细胞增殖能力 | 第51-52页 |
| 4.3 CSFV载量 | 第52-53页 |
| 5. 小结 | 第53-54页 |
| 第三章 自然感染PCV2后免疫抑制性受体转录水平研究 | 第54-64页 |
| 1. 引言 | 第54页 |
| 2. 材料与方法 | 第54-57页 |
| 2.1 主要生物学试剂 | 第54页 |
| 2.2 主要溶液配制 | 第54页 |
| 2.3 主要仪器设备 | 第54页 |
| 2.4 试验动物 | 第54页 |
| 2.5 qPCR引物设计与合成 | 第54-55页 |
| 2.6 qPCR检测目的基因方法的建立 | 第55页 |
| 2.7 自然PCV2感染过程中主要免疫抑制性受体及细胞因子转录水平研究 | 第55-57页 |
| 2.7.1 试验动物 | 第55页 |
| 2.7.2 PMWS的PCR病原检测 | 第55-56页 |
| 2.7.3 qPCR检测免疫抑制性受体和细胞因子转录水平 | 第56-57页 |
| 2.7.4 检测PBMCs增殖能力 | 第57页 |
| 3. 结果与分析 | 第57-61页 |
| 3.1 qPCR检测CTLA-4、LAG-3、PTEN及细胞因子IFN-γ标准曲线的建立 | 第57-59页 |
| 3.2 PMWS的病原检测 | 第59页 |
| 3.3 qPCR检测主要免疫抑制性受体的基因转录水平 | 第59-60页 |
| 3.4 qPCR检测细胞因子IL-2、IFN-γ和IL-10转录变化 | 第60页 |
| 3.5 PBMCs增殖 | 第60-61页 |
| 4. 讨论 | 第61-63页 |
| 4.1 病原检测 | 第61-62页 |
| 4.2 PCV2感染后免疫抑制性受体和配体的表达 | 第62页 |
| 4.3 PCV2感染后细胞因子表达与PBMC增殖 | 第62-63页 |
| 5. 小结 | 第63-64页 |
| 第四章 阻断猪PD-1/PD-L1通路的多肽基序鉴定 | 第64-80页 |
| 1. 引言 | 第64-65页 |
| 2. 材料与方法 | 第65-72页 |
| 2.1 主要试剂及免疫动物 | 第65页 |
| 2.2 主要溶液配制 | 第65-66页 |
| 2.3 主要仪器设备 | 第66页 |
| 2.4 固相法合成多肽基本流程 | 第66页 |
| 2.5 多肽设计 | 第66-67页 |
| 2.6 固相法合成多肽程序 | 第67-70页 |
| 2.6.1 溶胀Rink amide-MBHA Resin树脂 | 第67-68页 |
| 2.6.2 多肽合成酰化程序 | 第68页 |
| 2.6.3 Kaiser法检测多肽合成缩合反应 | 第68页 |
| 2.6.4 脱保护基团 | 第68-69页 |
| 2.6.5 多肽合成重复程序 | 第69页 |
| 2.6.6 TFA法裂解多肽 | 第69页 |
| 2.6.7 合成多肽沉淀及脱盐纯化 | 第69-70页 |
| 2.6.8 鉴定合成多肽纯度及结构特性 | 第70页 |
| 2.7 多肽的溶解 | 第70页 |
| 2.8 多肽标记FITC | 第70页 |
| 2.9 多肽PD-15阻断PD-1/PD-L1通路促进PBMC增殖能力 | 第70-71页 |
| 2.10 多肽PD-15与猪重组蛋白PD-L1结合 | 第71页 |
| 2.11 FITC标记多肽与PBMC结合 | 第71页 |
| 2.12 多肽PD-15作为佐剂免疫效果评价 | 第71-72页 |
| 2.12.1 免疫小鼠 | 第71-72页 |
| 2.12.2 ELISA检测抗体水平 | 第72页 |
| 3. 结果与分析 | 第72-76页 |
| 3.1 多肽PD-15阻断后对PBMCs增殖影响 | 第72页 |
| 3.2 多肽PD-15与猪重组蛋白PD-L1的结合 | 第72-73页 |
| 3.3 多肽PD-15与PBMCs结合 | 第73-74页 |
| 3.4 测定多肽PD-15纯度及氨基酸序列 | 第74页 |
| 3.5 多肽PD-15对体液免疫的影响 | 第74-76页 |
| 4. 讨论 | 第76-79页 |
| 4.1 固相多肽合成 | 第76-77页 |
| 4.2 多肽溶解 | 第77-78页 |
| 4.3 多肽阻断PD-1/PD-L1通路促进PBMC增殖 | 第78-79页 |
| 4.5 PD-15作为免疫佐剂对抗体水平的影响 | 第79页 |
| 5. 小结 | 第79-80页 |
| 第五章 全文结论 | 第80-81页 |
| 参考文献 | 第81-101页 |
| 致谢 | 第101-102页 |
| 附录1 患PMWS断奶仔猪图片 | 第102-103页 |
| 博士期间发表论文及成果 | 第103页 |
