| 中文摘要 | 第6-8页 |
| Abstract | 第8-9页 |
| 缩略语 | 第13-15页 |
| 引言 | 第15-16页 |
| 第一章 文献综述 | 第16-28页 |
| 综述一 精子发生和获能研究 | 第16-21页 |
| 1 精子发生机制研究 | 第16-18页 |
| 1.1 精子发生过程 | 第16-17页 |
| 1.2 精子发生调控 | 第17-18页 |
| 2 精子获能机制研究 | 第18页 |
| 3 去能因子研究 | 第18-21页 |
| 3.1 丝氨酸蛋白酶抑制剂 | 第19页 |
| 3.2 羧酸酯酶类7(CEs7) | 第19-20页 |
| 3.3 NYD-SP27 | 第20-21页 |
| 综述二 磷脂酶C家族与生殖 | 第21-25页 |
| 1 磷脂酶C概述 | 第21-22页 |
| 1.1 磷脂酶C的活化 | 第21页 |
| 1.2 PLC的种类 | 第21-22页 |
| 2 PLCζ的研究进展 | 第22-23页 |
| 2.1 PLCζ的发现 | 第22页 |
| 2.2 PLCζ的结构域 | 第22-23页 |
| 3 NYD-SP27的研究进展 | 第23-25页 |
| 综述三 RNA干扰研究 | 第25-28页 |
| 1 RNA干扰 | 第25-26页 |
| 1.1 RNA干扰的过程 | 第25页 |
| 1.2 RNA干扰的应用 | 第25-26页 |
| 2 慢病毒介导的RNA干扰 | 第26-28页 |
| 2.1 病毒载体介绍 | 第26-27页 |
| 2.2 慢病毒介导的RNA干扰机制 | 第27页 |
| 2.3 慢病毒介导的RNA干扰应用 | 第27-28页 |
| 第二章 实验研究 | 第28-64页 |
| 实验一 绵羊NYD-SP27基因的克隆及真核表达载体的构建 | 第28-41页 |
| 1 材料与方法 | 第28-35页 |
| 1.1 材料 | 第29页 |
| 1.1.1 菌株、载体及动物组织 | 第29页 |
| 1.1.2 主要试剂 | 第29页 |
| 1.1.3 主要仪器和设备 | 第29页 |
| 1.2 方法 | 第29-35页 |
| 1.2.1 引物设计与合成 | 第29页 |
| 1.2.2 绵羊睾丸组织总RNA提取 | 第29-30页 |
| 1.2.3 RNA反转录合成cDNA | 第30页 |
| 1.2.4 绵羊NYD-SP27基因的克隆 | 第30-31页 |
| 1.2.5 目的片段与pMD19-T载体连接 | 第31-32页 |
| 1.2.6 连接产物转化 | 第32-33页 |
| 1.2.7 菌液PCR鉴定阳性克隆 | 第33页 |
| 1.2.8 保存阳性克隆菌株 | 第33页 |
| 1.2.9 测序结果比对分析 | 第33页 |
| 1.2.10 扩增P2A-Flag-NYD-SP27基因 | 第33-34页 |
| 1.2.11 目的片段连接pMD19-T载体连接 | 第34页 |
| 1.2.12 连接产物转化、菌液PCR鉴定、测序鉴定 | 第34页 |
| 1.2.13 质粒提取 | 第34页 |
| 1.2.14 重组质粒双酶切鉴定 | 第34页 |
| 1.2.15 目的片段与表达载体连接 | 第34-35页 |
| 1.2.16 重组载体的转化 | 第35页 |
| 1.2.17 重组慢病毒质粒的提取及双酶切鉴定 | 第35页 |
| 2 结果 | 第35-39页 |
| 2.1 绵羊NYD-SP27基因的克隆 | 第35页 |
| 2.2 绵羊NYD-SP27基因序列分析结果 | 第35-37页 |
| 2.3 P2A-Flag-NYDSP基因扩增 | 第37-38页 |
| 2.4 绵羊NYD-SP27基因真核表达载体的鉴定 | 第38-39页 |
| 3 讨论 | 第39-41页 |
| 实验二 绵羊NYD-SP27基因在BHK-21细胞中稳定表达以及特征鉴定 | 第41-53页 |
| 1 材料与方法 | 第41-47页 |
| 1.1 材料 | 第41-42页 |
| 1.1.1 细胞、菌株和载体 | 第41页 |
| 1.1.2 试剂 | 第41-42页 |
| 1.1.3 主要仪器设备 | 第42页 |
| 1.2 方法 | 第42-47页 |
| 1.2.1 重组质粒pDsRed1-P2A-Flag-NYDSP的大量提取 | 第42页 |
| 1.2.2 BHK-21细胞的培养 | 第42-43页 |
| 1.2.3 重组质粒转染BHK-21细胞 | 第43-44页 |
| 1.2.4 G418筛选及阳性细胞的筛选 | 第44页 |
| 1.2.5 阳性细胞BHK-21细胞基因组DNA的PCR鉴定细胞 | 第44-45页 |
| 1.2.6 RT-PCR鉴定单克隆细胞 | 第45页 |
| 1.2.7 间接免疫荧光鉴定 | 第45-46页 |
| 1.2.8 Westen Blot检测绵羊NYD-SP27蛋白在稳定细胞系中的表达 | 第46-47页 |
| 1.2.9 稳定细胞系生长曲线测定 | 第47页 |
| 2 结果 | 第47-51页 |
| 2.1 重组质粒转染BHK-21细胞 | 第47-48页 |
| 2.2 阳性细胞基因组DNA鉴定单克隆细胞 | 第48页 |
| 2.3 RT-PCR鉴定单克隆细胞 | 第48-49页 |
| 2.4 IFA鉴定稳定细胞系 | 第49-50页 |
| 2.5 Western blot鉴定稳定细胞系 | 第50页 |
| 2.6 稳定转染细胞生长曲线测定 | 第50-51页 |
| 3 讨论 | 第51-53页 |
| 实验三 绵羊NYD-SP27基因慢病毒干扰载体的构建及筛选 | 第53-64页 |
| 1 材料与方法 | 第53-58页 |
| 1.1 材料 | 第53-54页 |
| 1.1.1 载体及细胞 | 第54页 |
| 1.1.2 主要试剂和设备 | 第54页 |
| 1.2 方法 | 第54-58页 |
| 1.2.1 靶向干扰片段的设计合成 | 第54-55页 |
| 1.2.2 慢病毒干扰载体的构建 | 第55-56页 |
| 1.2.3 慢病毒包装 | 第56-57页 |
| 1.2.4 慢病毒滴度测定(GFP荧光计数法) | 第57页 |
| 1.2.5 慢病毒感染靶细胞 | 第57页 |
| 1.2.6 荧光实时定量PCR(qRT-PCR)检测绵羊NYD-SP27的相对表达量 | 第57-58页 |
| 2 结果 | 第58-63页 |
| 2.1 shRNA-pLL3.7慢病毒干扰载体的构建 | 第58-59页 |
| 2.2 HEK-293FT细胞包装重组慢病毒 | 第59-60页 |
| 2.3 慢病毒感染靶细胞 | 第60-61页 |
| 2.4 荧光实时定量PCR筛选效率干扰片段 | 第61-63页 |
| 3 讨论 | 第63-64页 |
| 全文总结 | 第64-65页 |
| 创新点 | 第65-66页 |
| 参考文献 | 第66-72页 |
| 致谢 | 第72-73页 |
| 作者简介 | 第73-74页 |
| 石河子大学硕士研究生学位论文导师评阅表 | 第74页 |
