| 摘要 | 第1-8页 |
| ABSTRACT | 第8-10页 |
| 符号说明 | 第10-12页 |
| 第一章 前言 | 第12-24页 |
| 第一节 概述 | 第12-13页 |
| 第二节 昆虫蜕皮变态的分子机制 | 第13-24页 |
| 一. 20E基因组信号途径 | 第13-17页 |
| 二. 20E的非基因组信号途径 | 第17-19页 |
| 三. 保幼激素信号转导途径 | 第19-23页 |
| 四. 保幼激素信号途径和蜕皮激素信号途径的相互作用 | 第23页 |
| 五. 本论文的科学问题及研究意义 | 第23-24页 |
| 第二章 磷酸化的Methoprene耐受基因1和非磷酸化的超气门蛋白1形成转录复合体促进基因转录维持幼虫状态 | 第24-68页 |
| 一.引言 | 第24-25页 |
| 二.实验方法和材料 | 第25-41页 |
| 1. 实验材料 | 第25-27页 |
| 2. 实验方法 | 第27-41页 |
| ·基因克隆和生物信息学分析 | 第27-28页 |
| ·重组表达和抗体制备 | 第28-31页 |
| ·免疫印迹 | 第31-32页 |
| ·总RNA提取 | 第32-33页 |
| ·反转cDNA | 第33页 |
| ·实时荧光定量PCR(qRT-PCR) | 第33-34页 |
| ·激素刺激 | 第34页 |
| ·RNA干扰 | 第34-35页 |
| ·细胞系过表达 | 第35页 |
| ·HE染色 | 第35-36页 |
| ·免疫共沉淀(Co-IP) | 第36-37页 |
| ·凝胶迁移实验(EMSA) | 第37-39页 |
| ·CNBr-活化琼脂糖4B纯化Met1蛋白 | 第39页 |
| ·缺失突变 | 第39-40页 |
| ·Met1磷酸化水平检测 | 第40页 |
| ·染色质免疫沉淀(ChIP) | 第40-41页 |
| 三.实验结果 | 第41-64页 |
| 1. Met1基因序列克隆及分析 | 第41-44页 |
| 2. Met1的蛋白原核表达及多克隆抗体制备 | 第44-45页 |
| 3. Met1在幼虫取食期表达量高但在变态期表达量低 | 第45-46页 |
| 4. 干扰Met1后影响基因转录导致化蛹提前 | 第46-48页 |
| 5. 细胞系干扰Met1抑制JH通路基因转录并促进20E通路基因转录 | 第48-49页 |
| 6. 细胞系中过表达Met1促进JH所诱导的相关基因的转录同时抑制20E所诱导的相关基因的转录 | 第49-50页 |
| 7. JH Ⅲ和20E打破Met1-Met1二聚 | 第50-52页 |
| 8. JH Ⅲ诱导Met1的PAC结构域发生磷酸化进而打破Met1-Met1二聚 | 第52-54页 |
| 9. Met1结合Hsp90作为复合体结合Kr-h1基因启动子JHRE序列 | 第54-56页 |
| 10. Met1抑制EcR-B1与USP1的结合 | 第56-58页 |
| 11. Met1结合非磷酸化的USP1,不能结合20E所诱导磷酸化的USP1 | 第58-60页 |
| 12. Met1的C端决定Met1和USP1的结合 | 第60-62页 |
| 13. JH Ⅲ诱导下,Met1同源二聚体解聚与USP1互作才能结合JHRE来起始Krh1的转录 | 第62-64页 |
| 四.讨论 | 第64-66页 |
| 1. Met1的表达受JH和20E共同调控 | 第64页 |
| 2. JHⅢ诱导Met1的PAC结构域磷酸化使Met1-Met1同源二聚解离 | 第64-65页 |
| 3. 磷酸化的Met和非磷酸化的USP1形成复合体起始JH通路维持幼虫状态 | 第65-66页 |
| 4. Met1抑制20E通路基因转录进而阻止变态发生 | 第66页 |
| 5. 20E诱导USP1发生磷酸化进而破坏其与Met1的结合 | 第66页 |
| 五.结论 | 第66-68页 |
| 第三章 G蛋白偶联受体激酶2终止蜕皮激素膜信号通路中G蛋白偶联受体的功能 | 第68-92页 |
| 一.引言 | 第68-69页 |
| 二.实验方法和材料 | 第69-73页 |
| 1. 实验材料 | 第69页 |
| 2. 实验方法 | 第69-73页 |
| ·GRK2的基因克隆及生物信息学分析 | 第69-70页 |
| ·重组表达和多克隆抗体制备 | 第70页 |
| ·免疫印迹分析 | 第70页 |
| ·总RNA提取 | 第70-71页 |
| ·反转cDNA | 第71页 |
| ·实时荧光定量反转录PCR(qRT-PCR) | 第71页 |
| ·激素刺激 | 第71页 |
| ·RNA干扰 | 第71页 |
| ·免疫细胞化学 | 第71-72页 |
| ·免疫共沉淀(Co-IP) | 第72页 |
| ·细胞膜和细胞质蛋白提取 | 第72-73页 |
| ·活细胞Caspase-3活性检测 | 第73页 |
| ·GRK2磷酸化水平检测 | 第73页 |
| ·受体光漂白荧光能量共振转移(Ap-Fret) | 第73页 |
| 三.实验结果 | 第73-88页 |
| 1. GRK2基因克隆与分析 | 第73-77页 |
| 2. GRK2多克隆抗体制备 | 第77页 |
| 3. GRK2在棉铃虫变态期高表达 | 第77-79页 |
| 4. 干扰GRK2促进变态和20E通路中基因转录 | 第79-80页 |
| 5. 干扰GRK2后促进20E所诱导的凋亡 | 第80-81页 |
| 6. 棉铃虫表皮细胞中20E诱导GRK2向细胞膜移动 | 第81-84页 |
| 7. 680位丝氨酸磷酸化决定GRK2向膜移动 | 第84-86页 |
| 8. GRK2磷酸化ErGPCR-2并介导ErGPCR-2内吞 | 第86-88页 |
| 四.讨论 | 第88-90页 |
| 1. 20E上调GRK2的表达 | 第88-89页 |
| 2. 20E诱导下,PKC介导的磷酸化决定着GRK2的向膜移动 | 第89页 |
| 3. 20E信号的负反馈调控 | 第89-90页 |
| 五.结论 | 第90-92页 |
| 创新点总结 | 第92-94页 |
| 展望 | 第94-96页 |
| 参考文献 | 第96-104页 |
| 致谢 | 第104-106页 |
| 在读期间发表论文 | 第106-107页 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 | 第107页 |
