| 本论文的创新点 | 第1-9页 |
| 摘要 | 第9-11页 |
| Abstract | 第11-13页 |
| 引言 | 第13-15页 |
| 第一部分 概述冠状病毒及其反向遗传学系统和加帽修饰 | 第15-56页 |
| 1 冠状病毒 | 第15-40页 |
| ·冠状病毒造成的疾病 | 第15-17页 |
| ·人冠状病毒 | 第15-16页 |
| ·鼠冠状病毒 | 第16-17页 |
| ·冠状病毒 | 第17-29页 |
| ·冠状病毒的分类 | 第17-18页 |
| ·冠状病毒基因组及病毒粒子 | 第18-19页 |
| ·冠状病毒的生活周期 | 第19-20页 |
| ·冠状病毒的复制 | 第20-22页 |
| ·病毒蛋白 | 第22-29页 |
| ·冠状病毒的反向遗传学 | 第29-34页 |
| ·定向重组 | 第30-31页 |
| ·从cDNA中重新形成病毒的反向遗传学系统 | 第31-34页 |
| ·冠状病毒与先天免疫逃逸 | 第34-37页 |
| ·宿主抗病毒先天免疫及对SARS-CoV感染的反应 | 第35-36页 |
| ·SARS-CoV通过DMVs保护及加帽修饰逃逸宿主先天免疫的识别 | 第36-37页 |
| ·抗冠状病毒药物研究进展 | 第37-40页 |
| ·抗冠状病毒药物 | 第37-39页 |
| ·冠状病毒疫苗 | 第39-40页 |
| 2 mRNA加帽机制及其功能酶研究概要 | 第40-56页 |
| ·5’末端帽子的结构、功能及加帽过程 | 第40-42页 |
| ·加帽修饰相关功能酶简介 | 第42-45页 |
| ·RNA三磷酸酶的结构与作用机制 | 第42-43页 |
| ·鸟苷酸转移酶的结构与作用机制 | 第43-44页 |
| ·甲基转移酶的结构和作用机制 | 第44-45页 |
| ·生物体内参与加帽过程的酶组成 | 第45-46页 |
| ·病毒的加帽机制 | 第46-50页 |
| ·病毒传统的加帽修饰方式 | 第47-48页 |
| ·病毒非传统的加帽方式 | 第48-50页 |
| ·病毒加帽修饰与先天免疫 | 第50-52页 |
| ·针对加帽酶的抑制剂 | 第52-54页 |
| ·三磷酸酶抑制剂 | 第52页 |
| ·鸟苷酸转移酶抑制剂 | 第52-53页 |
| ·甲基化转移酶抑制剂 | 第53-54页 |
| ·甲基供体SAM的基本特性 | 第54-56页 |
| 第二部分 冠状病毒甲基转移酶抑制剂的筛选 | 第56-88页 |
| 3 酵母菌功能性互补及酵母生长抑制系统的构建_筛选冠状病毒甲基转移酶抑制剂 | 第56-88页 |
| ·研究背景概述 | 第56-58页 |
| ·实验材料 | 第58-62页 |
| ·实验仪器 | 第58-59页 |
| ·菌种及质粒 | 第59页 |
| ·工具酶、试剂盒及试剂 | 第59-61页 |
| ·相关溶液 | 第61-62页 |
| ·实验方法、原理 | 第62-78页 |
| ·引物设计 | 第63-64页 |
| ·酵母菌表达质粒及原核表达质粒的构建 | 第64-65页 |
| ·DNA目的片段扩增及质粒DNA的实验操作 | 第65-71页 |
| ·酵母表达质粒的转化 | 第71-72页 |
| ·转化酵母菌在5-FOA上的筛选 | 第72-73页 |
| ·冠状病毒nsp14的体外表达、纯化、活性测试及药物抑制 | 第73-78页 |
| ·实验结果及讨论部分 | 第78-88页 |
| ·所有冠状病毒nsp14都能互补酵母N7-MTase的功能 | 第78-79页 |
| ·对数生长期内吸光值法能准确反映酵母细胞的数目 | 第79-81页 |
| ·体外生化检测药物对冠状病毒N7-MTase活性的影响 | 第81-82页 |
| ·以酵母遗传学为基础冠状病毒N7-MTase抑制剂筛选平台的建立 | 第82-84页 |
| ·检测酵母遗传学为基础的筛选平台的有效性 | 第84-85页 |
| ·蹄选抑制冠状病毒N7-MTase的天然化合物药库 | 第85-86页 |
| ·优化冠状病毒N7-MTase抑制剂的筛选体系 | 第86-88页 |
| 第三部分 鼠肝炎冠状病毒反向遗传学系统的建立 | 第88-126页 |
| 4 重组突变鼠肝炎冠状病毒的构建 | 第88-123页 |
| ·研究背景概述 | 第88-90页 |
| ·实验材料 | 第90-93页 |
| ·实验仪器 | 第90页 |
| ·病毒、菌种及质粒 | 第90-91页 |
| ·实验用耗材 | 第91-93页 |
| ·实验方法及原理 | 第93-109页 |
| ·引物设计 | 第93-94页 |
| ·以痘苗病毒为载体的全长MHV重组病毒(V.V-inf-1)的扩增及噬斑分析 | 第94-95页 |
| ·pGPT-out-nsp14同源重组质粒的构建 | 第95-96页 |
| ·痘苗病毒介导的同源重组 | 第96-97页 |
| ·GPT双向筛选 | 第97-100页 |
| ·重组痘苗病毒DNA的提取及PCR鉴定 | 第100-102页 |
| ·GPT-Out重组痘苗病毒DNA的提取、酶切与体外转录 | 第102-105页 |
| ·突变MHV基因组全长RNA的转染及拯救 | 第105-106页 |
| ·MHV突变体的纯化与鉴定 | 第106-108页 |
| ·MHV突变体生长曲线的测定 | 第108-109页 |
| ·实验结果及讨论 | 第109-123页 |
| ·重组痘苗病毒V.V-MHV-A59 nsp14-gpt in的增殖及滴度测定 | 第109-110页 |
| ·鼠肝炎冠状病毒基因组DNA的定向突变 | 第110-115页 |
| ·MHV突变体的拯救 | 第115-119页 |
| ·MHV-nsp14-mutants的增殖、噬斑分析及温度敏感性测试 | 第119-121页 |
| ·MHV-nsp14-mutants生长曲线的测定 | 第121-123页 |
| 5 讨论与展望 | 第123-126页 |
| 参考文献 | 第126-136页 |
| 研究生期间发表论文 | 第136-137页 |
| 致谢 | 第137-138页 |
