| 摘要 | 第1-5页 |
| Abstract | 第5-7页 |
| 缩略词 | 第7-12页 |
| 第一章 绪论 | 第12-29页 |
| ·毕赤酵母中用于高效表达外源蛋白基因的启动子 | 第12-15页 |
| ·AOX1 启动子 | 第12-13页 |
| ·GAP启动子 | 第13-14页 |
| ·其他启动子 | 第14-15页 |
| ·毕赤酵母分泌途径的遗传修饰 | 第15-21页 |
| ·经典的分泌途径 | 第15-17页 |
| ·遗传改造内质网驻留蛋白增强外源蛋白的分泌表达 | 第17-18页 |
| ·未折叠蛋白响应(UPR)及对其信号转导途径的操纵 | 第18-20页 |
| ·修饰强化分泌途径中的的囊泡运输过程 | 第20-21页 |
| ·结合高通量实验技术和生物信息学手段增强外源蛋白的分泌表达 | 第21页 |
| ·毕赤酵母蛋白酶的研究进展 | 第21-27页 |
| ·胞质蛋白酶 | 第22页 |
| ·液泡蛋白酶 | 第22-23页 |
| ·分泌途径蛋白酶 | 第23-24页 |
| ·糖基磷脂酰肌醇(GPI-)锚定的天冬氨酸蛋白酶(Yapsin) | 第24-27页 |
| ·本论文的主要研究内容 | 第27-29页 |
| 第二章 融合蛋白rhIL-2-HSA在毕赤酵母中的组成型分泌表达 | 第29-42页 |
| ·前言 | 第29页 |
| ·材料与方法 | 第29-35页 |
| ·菌株、细胞株及质粒 | 第29页 |
| ·培养基及试剂 | 第29-31页 |
| ·分子克隆和蛋白质分析方法 | 第31页 |
| ·毕赤酵母感受态细胞的制备及其遗传转化 | 第31-32页 |
| ·融合蛋白在毕赤酵母中的发酵表达 | 第32页 |
| ·融合蛋白的纯化 | 第32-33页 |
| ·发酵过程菌体生长和蛋白表达相关参数的测定 | 第33-34页 |
| ·IL-2 依赖的CTLL-2 细胞增殖活性(MTT法)测定 | 第34-35页 |
| ·结果与讨论 | 第35-41页 |
| ·融合蛋白rhIL-2-HSA的PGAP表达质粒的构建 | 第35页 |
| ·rhIL-2-HSA融合蛋白PGAP表达菌株的构建 | 第35-36页 |
| ·碳源、培养温度和初始pH对rhIL-2-HSA融合蛋白表达的影响 | 第36-37页 |
| ·毕赤酵母组成型表达rhIL-2-HSA融合蛋白的Western blot鉴定 | 第37页 |
| ·5 L发酵罐rhIL-2-HSA融合蛋白组成型发酵表达 | 第37-39页 |
| ·融合蛋白rhIL-2-HSA的纯化和活性测定 | 第39-41页 |
| ·本章小结 | 第41-42页 |
| 第三章 共表达分泌辅助因子对毕赤酵母分泌表达rhIL-2-HSA融合蛋白的影响 | 第42-56页 |
| ·前言 | 第42页 |
| ·材料与方法 | 第42-46页 |
| ·菌株及质粒 | 第42页 |
| ·培养基 | 第42-43页 |
| ·试剂及仪器 | 第43页 |
| ·发酵条件及酵母生物量的测定 | 第43-44页 |
| ·毕赤酵母分泌辅助因子共表达质粒的构建 | 第44-45页 |
| ·共表达质粒转化毕赤酵母及阳性转化子的筛选鉴定 | 第45页 |
| ·毕赤酵母基因组DNA的提取 | 第45页 |
| ·毕赤酵母胞内蛋白的提取 | 第45页 |
| ·蛋白和转录水平分析方法 | 第45-46页 |
| ·结果与分析 | 第46-53页 |
| ·分泌辅助因子共表达质粒的构建 | 第46-48页 |
| ·分泌辅助因子共表达菌株的构建及鉴定 | 第48-49页 |
| ·共表达分泌辅助因子对毕赤酵母分泌表达rhIL-2-HSA的影响 | 第49-51页 |
| ·共表达分泌辅助因子对胞内rhIL-2-HSA含量的影响 | 第51-52页 |
| ·共表达分泌辅助因子对rhIL-2-HSA基因及相关辅助因子转录的影响 | 第52-53页 |
| ·讨论 | 第53-55页 |
| ·本章小结 | 第55-56页 |
| 第四章 Yapsin蛋白酶对毕赤酵母分泌表达HSA融合蛋白的影响 | 第56-70页 |
| ·前言 | 第56-57页 |
| ·材料与方法 | 第57-62页 |
| ·菌株及质粒 | 第57页 |
| ·培养基 | 第57页 |
| ·试剂及主要仪器 | 第57页 |
| ·融合PCR构建基因敲除打靶分子 | 第57-59页 |
| ·酵母转化 | 第59-60页 |
| ·酵母转化子的鉴定 | 第60-61页 |
| ·表达质粒pPIC9K-HSA-ADAM15 转化Yapsin蛋白酶缺陷菌株 | 第61页 |
| ·毕赤酵母多基因敲除菌株的构建策略 | 第61-62页 |
| ·基因敲除菌株中Zeocin抗性标记的去除 | 第62页 |
| ·结果与讨论 | 第62-69页 |
| ·Yapsin蛋白酶基因敲除打靶分子的构建 | 第62-63页 |
| ·Yapsin蛋白酶基因敲除菌株的构建及分子鉴定 | 第63-64页 |
| ·敲除单个Yapsin蛋白酶基因对融合蛋白HSA-ADAM15 分泌表达的影响 | 第64-65页 |
| ·毕赤酵母多重Yapsin蛋白酶基因敲除菌株的获得和鉴定 | 第65-67页 |
| ·敲除多个Yapsin蛋白酶基因对融合蛋白HSA-ADAM15 分泌表达的影响 | 第67-69页 |
| ·本章小结 | 第69-70页 |
| 第五章 毕赤酵母Yapsin蛋白酶Yps7 的功能分析 | 第70-79页 |
| ·前言 | 第70页 |
| ·材料与方法 | 第70-73页 |
| ·菌株及质粒 | 第70页 |
| ·培养基 | 第70-71页 |
| ·试剂 | 第71页 |
| ·基因敲除菌株相关生长表型分析(滴板实验) | 第71页 |
| ·酵母细胞壁几丁质的荧光染色分析 | 第71-72页 |
| ·酵母细胞壁几丁质含量的测定 | 第72页 |
| ·酵母细胞壁β-1,3-葡聚糖相对含量的测定 | 第72页 |
| ·酵母细胞胞内甘油含量的测定 | 第72-73页 |
| ·酵母细胞的透射电镜(TEM)分析 | 第73页 |
| ·结果与分析 | 第73-77页 |
| ·Yapsin蛋白酶基因敲除菌株的生长表型分析 | 第73-74页 |
| ·敲除YPS7 基因对毕赤酵母细胞壁组成成分的影响 | 第74页 |
| ·敲除YPS7 基因对毕赤酵母细胞壁几丁质荧光染色的影响 | 第74-75页 |
| ·敲除YPS7 基因对毕赤酵母渗透胁迫下胞内甘油含量的影响 | 第75-76页 |
| ·敲除YPS7 基因对毕赤酵母细胞壁形态的影响 | 第76页 |
| ·敲除多个Yapsin蛋白酶基因对敲除菌株生长表型的影响 | 第76-77页 |
| ·讨论 | 第77-78页 |
| ·Yapsin蛋白酶基因敲除菌株Yps7Δ对细胞壁合成干扰试剂的抗性增强 | 第77-78页 |
| ·Yapsin蛋白酶基因敲除菌株Yps7Δ对渗透胁迫的抗性增强 | 第78页 |
| ·本章小结 | 第78-79页 |
| 主要结论与展望 | 第79-81页 |
| 论文创新点 | 第81-82页 |
| 致谢 | 第82-83页 |
| 参考文献 | 第83-92页 |
| 附录 | 第92页 |
