| 中文摘要 | 第1-4页 |
| ABSTRACT | 第4-6页 |
| 目录 | 第6-10页 |
| 缩写 | 第10-11页 |
| 第一章 前言 | 第11-17页 |
| 一、烟碱类农药概述 | 第11-12页 |
| 二、烟碱类杀虫剂THI的代谢研究 | 第12-14页 |
| (一) TH在植物和动物中的代谢 | 第12-13页 |
| (二) THI的土壤代谢 | 第13-14页 |
| 三、腈水合酶的研究 | 第14-15页 |
| 四、本论文的研究思路 | 第15-17页 |
| 第二章 V.boronicumulans J1腈水合酶基因的克隆的研究 | 第17-33页 |
| 1 实验材料 | 第17-20页 |
| ·菌株和质粒 | 第17页 |
| ·培养基的配制 | 第17-18页 |
| ·主要试剂及来源 | 第18页 |
| ·主要仪器设备及其来源 | 第18页 |
| ·主要溶液配制 | 第18-19页 |
| ·酶 | 第19页 |
| ·PCR引物 | 第19页 |
| ·其他材料 | 第19-20页 |
| ·菌株培养与保藏 | 第20页 |
| 2 实验方法 | 第20-27页 |
| ·基因组DNA的提取 | 第20页 |
| ·设计引物进行PCR扩增 | 第20-24页 |
| ·α亚基基因的克隆 | 第20-22页 |
| ·α亚基基因156bp片段的克隆 | 第20-21页 |
| ·α亚基基因421bp片段的克隆 | 第21-22页 |
| ·V.boronicumulans J1腈水合酶α亚基基因下游和β亚基基因上游927bp片段的克隆 | 第22页 |
| ·V.boronicumulans J1腈水合酶α亚基基因上游1300bp片段的克隆 | 第22-23页 |
| ·V.boronicumulans J1腈水合酶β亚基基因下游989bp片段的克隆 | 第23-24页 |
| ·PCR产物纯化回收 | 第24-25页 |
| ·PCR产物装TA克隆 | 第25页 |
| ·感受态细胞制备及转化 | 第25-26页 |
| ·阳性克隆的筛选 | 第26页 |
| ·测序验证 | 第26-27页 |
| 3 实验结果 | 第27-31页 |
| ·V.boronicumulans J1基因组的提取 | 第27页 |
| ·PCR结果 | 第27-28页 |
| ·阳性克隆的筛选结果 | 第28-29页 |
| ·测序、拼接及序列比对结果 | 第29-31页 |
| ·测序和拼接结果 | 第29页 |
| ·2629bp DNA序列生物信息学分析结果 | 第29-31页 |
| ·腈水合酶种类考察结果 | 第31页 |
| 4 讨论 | 第31-33页 |
| 第三章 V.boronicumulans J1腈水合酶及其激活蛋白的表达与酶活性分析 | 第33-58页 |
| 1 实验材料 | 第33-37页 |
| ·菌种和质粒 | 第33页 |
| ·培养基的配制 | 第33-34页 |
| ·主要试剂及来源 | 第34-35页 |
| ·主要仪器设备及其来源 | 第35页 |
| ·主要溶液配制 | 第35-36页 |
| ·酶 | 第36页 |
| ·PCR引物 | 第36-37页 |
| ·其他材料 | 第37页 |
| ·菌株培养与保藏 | 第37页 |
| 2 实验方法 | 第37-48页 |
| ·PCR扩增 | 第37-39页 |
| ·扩增两端含粘性末端的腈水合酶基因片段 | 第37-38页 |
| ·扩增两端含粘性末端的腈水合酶基因和激活蛋白基因片段 | 第38-39页 |
| ·扩增两端含粘性末端的腈水合酶激活蛋白基因片段 | 第39页 |
| ·PCR产物纯化回收 | 第39页 |
| ·制备含粘性末端的DNA片段 | 第39-42页 |
| ·DNA片段连接pMD-18T载体 | 第39-40页 |
| ·电转化E.coli DH10B感受态细胞的制备及转化 | 第40-41页 |
| ·阳性克隆的筛选及酶切片段回收 | 第41-42页 |
| ·质粒提取 | 第41-42页 |
| ·DNA片段双酶切及回收 | 第42页 |
| ·构建表达载体并转化至E.coli BL21 | 第42-43页 |
| ·制备PET载体 | 第42页 |
| ·含粘性末端的目的DNA片段与PET载体的连接 | 第42-43页 |
| ·表达质粒电击转化入表达菌株E.coli BL21 | 第43页 |
| ·阳性克隆筛选 | 第43页 |
| ·目的蛋白的诱导表达及表达条件的优化 | 第43-44页 |
| ·SDS-PAGE检测目的蛋白表达情况 | 第44-45页 |
| ·Western blot检测目的蛋白的表达情况 | 第45-46页 |
| ·腈水合酶活性分析 | 第46-47页 |
| ·菌株的培养 | 第46页 |
| ·静息细胞转化烟碱类杀虫剂噻虫啉(THI) | 第46-47页 |
| ·HPLC分析 | 第47页 |
| ·转化产物的LC-MS分析 | 第47页 |
| ·转化产物提取与纯化 | 第47页 |
| ·转化产物的核磁共振光谱分析 | 第47-48页 |
| 3 结果 | 第48-56页 |
| ·PCR结果 | 第48页 |
| ·目的片段连pMD-18T阳性克隆筛选结果 | 第48-49页 |
| ·目的片段连pET-28a表达载体 | 第49-50页 |
| ·各目的基因诱导表达SDS-PAGE电泳结果 | 第50-52页 |
| ·目的蛋白Western blot检测结果 | 第52页 |
| ·静息细胞转化噻虫啉结果 | 第52-55页 |
| ·转化产物LC-MS分析结果 | 第55页 |
| ·转化产物的核磁共振光谱分析结果 | 第55-56页 |
| 4 讨论 | 第56-58页 |
| 第四章 腈水合酶过表达菌株对3-氰基吡啶的酶活性分析 | 第58-64页 |
| 1 实验材料 | 第58-59页 |
| ·菌种 | 第58页 |
| ·培养基的配制 | 第58页 |
| ·主要试剂及来源 | 第58-59页 |
| ·主要仪器设备及其来源 | 第59页 |
| ·主要溶液配制 | 第59页 |
| ·菌株培养与保藏 | 第59页 |
| 2 实验方法 | 第59-61页 |
| ·菌株培养 | 第59-60页 |
| ·目的蛋白的诱导表达 | 第59页 |
| ·对照菌株的培养 | 第59-60页 |
| ·静息细胞转化3-氰基吡啶 | 第60页 |
| ·诱导菌株细胞粗提液腈水合酶的活性分析 | 第60页 |
| ·HPLC分析 | 第60-61页 |
| 3 实验结果 | 第61-63页 |
| ·静息细胞转化3-氰基吡啶结果 | 第61-62页 |
| ·诱导菌株细胞粗提液腈水合酶的活性分析结果 | 第62-63页 |
| 4 讨论 | 第63-64页 |
| 参考文献 | 第64-68页 |
| 本文的创新和不足之处 | 第68-69页 |
| 致谢 | 第69-70页 |
| 附件 | 第70-72页 |
| 附件一：在读研究生期间主要科研情况 | 第70-71页 |
| 附件二：V.boronicumulans J1菌株腈水合酶基因核酸序列 | 第71-72页 |
| 附件三：V.boronicumulans J1菌株腈水合酶活化蛋白基因核酸序列 | 第72页 |
