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猪天然抗病毒分子APOBEC3F对猪内源性反转录病毒的抑制作用研究

缩略词表(Abbreviation)第1-9页
摘要第9-11页
Abstract第11-13页
前言第13-17页
材料与方法第17-37页
 1. 材料第17-19页
   ·实验动物第17页
   ·菌株、细胞株及质粒第17页
   ·分子生物学试剂及工具酶第17-18页
   ·主要仪器第18页
   ·细胞培养用品第18页
   ·基本溶液配制第18-19页
 2. 猪APOBEC3F 基因的克隆第19-23页
   ·猪APOBEC3F 基因克隆的引物设计与合成第19页
   ·五指山猪外周血单个核细胞的分离第19页
   ·PBMC 总RNA 的制备第19-20页
   ·反转录合成cDNA第20页
   ·PCR 扩增第20页
   ·pCDNA3-Flag-pA3F 载体的构建与鉴定第20-22页
     ·pCDNA3-Flag-pA3F 载体的构建第20-21页
     ·pCDNA3-Flag-pA3F 载体鉴定第21-22页
   ·pA3F 基因在PK-15 细胞中的表达与鉴定第22-23页
     ·质粒的准备第22-23页
     ·细胞培养与转染第23页
     ·pA3F 在PK-15 细胞中表达鉴定第23页
 3.pA3F 抑制PERV 病毒复制鉴定第23-28页
   ·pA3F 过表达对PERV 复制抑制作用鉴定第23-27页
     ·pA3F 在PK-15细胞中梯度表达鉴定第23-25页
     ·pA3F过表达抑制PERV pol m RNA的水平第25-26页
     ·pA3F 过表达抑制PERV 反转录酶水平第26-27页
   ·RNAi 沉默pA3F 基因与PERV 增殖的改变第27-28页
     ·pA3F 基因沉默与PERV 增殖改变第27-28页
     ·PERV反转录酶检测第28页
 4.pA3F 蛋白实现在PERV 粒子中的包装鉴定第28-30页
   ·转染质粒准备第28-29页
   ·细胞培养与转染第29页
   ·PERV病毒分离第29页
   ·PERV 对pA3F 蛋白的包装鉴定第29-30页
 5.PERV gag 基因的克隆第30-32页
   ·PERV gag 基因克隆的引物设计与合成第30-31页
   ·PERV病毒的增殖与分离第31页
   ·PERV病毒基因的提取第31页
   ·反转录合成cDNA第31页
   ·PCR 扩增第31页
   ·PCR 扩增产物的克隆与鉴定第31页
   ·PERV gag基因在K-15细胞中的表达与鉴定第31-32页
 6.pA3F 蛋白与PERV gag 蛋白之间的相互作用鉴定第32-34页
   ·转染质粒的准备第32页
   ·细胞培养与转染第32-33页
   ·免疫沉淀与免疫印迹第33-34页
 7.pA3F蛋白与PERV gag蛋白细胞内共定位观察第34-37页
   ·荧光质粒的构建与鉴定第34-35页
     ·引物设计与合成第34页
     ·PCR 扩增目的基因第34-35页
     ·荧光载体构建与鉴定第35页
   ·转染质粒的准备第35页
   ·细胞培养与转染第35-36页
   ·标本制备第36页
   ·激光共聚焦扫描显微镜观察共定位第36-37页
结果第37-55页
 1 pA3F 基因扩增与鉴定第37-39页
 2 pA3F 基因表达产物鉴定第39页
 3 pA3F 抑制PERV 复制鉴定第39-43页
   ·pA3F 在PK-15 细胞中的梯度表达鉴定第39-40页
   ·pA3F 过表达细胞中PERV pol 基因m RNA 改变第40-42页
   ·PERV反转录酶改变第42-43页
     ·标准曲线制作第42页
     ·反转录酶检测第42-43页
 4 pA3F 基因沉默与PERV 增殖的改变第43-46页
   ·pA3F 基因沉默与PERV pol m RNA 水平改变第43-45页
   ·PERV反转录酶检测第45-46页
 5 pA3F 实现在 PERV 颗粒中包装鉴定第46-48页
 6 PERV gag 基因扩增与鉴定第48-50页
 7 PERV gag 基因表达与鉴定第50-51页
 8 pA3F与PERV gag蛋白之间的相互作用鉴定第51-52页
 9 pA3F 与PERV gag 蛋白共定位观察第52-55页
讨论第55-61页
 1 APOBEC 家族的抗病毒作用与对PERV 抑制第55-56页
 2 pA3F 抗病毒机制第56-58页
 3 反转录病毒对APOBEC分子的抑制作用逃逸第58页
 4 pA3F 抑制PERV 作用的意义第58-61页
结论第61-63页
参考文献第63-71页
文献综述第71-83页
 参考文献第79-83页
附录第83-85页
个人简历第85-87页
致谢第87页

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