| 目录 | 第1-10页 |
| 摘要 | 第10-11页 |
| ABSTRACT | 第11-12页 |
| 前言 | 第12-36页 |
| 一、HPV病毒概述及研究进展 | 第12-22页 |
| ·HPV概述 | 第12-13页 |
| ·人乳头瘤病毒的分子生物学特点 | 第13-20页 |
| ·HPV的基因组及编码的蛋白 | 第13-15页 |
| ·HPV颗粒的主要形态结构 | 第15-17页 |
| ·HPV L1的主要抗原表位 | 第16-17页 |
| ·HPV L2的主要抗原表位 | 第17页 |
| ·HPV的感染和复制机制的研究 | 第17-18页 |
| ·人乳头瘤病毒引发的相关疾病 | 第18-20页 |
| ·HPV感染的分子生物学诊断 | 第20-22页 |
| ·HPV DNA检测 | 第21页 |
| ·HPV抗体检测 | 第21-22页 |
| 二、乳头瘤病毒感染模型 | 第22-26页 |
| ·乳头瘤感染动物模型 | 第22-23页 |
| ·HPV组织培养模型 | 第23-24页 |
| ·转基因动物模型 | 第24-25页 |
| ·HPV假病毒感染模型 | 第25-26页 |
| 三、人乳头瘤病毒疫苗的研究进展 | 第26-31页 |
| ·HPV治疗性疫苗 | 第26-27页 |
| ·HPV预防性疫苗 | 第27-28页 |
| ·类病毒颗粒(VLP)疫苗 | 第27-28页 |
| ·HPV预防性疫苗的研究现状 | 第28-30页 |
| ·疫苗研制中不同的表达体系 | 第30-31页 |
| ·真核表达系统 | 第31页 |
| ·原核表达系统 | 第31页 |
| 四、生物大分子三维结构研究 | 第31-34页 |
| ·X射线晶体学 | 第32页 |
| ·核磁共振波谱学 | 第32页 |
| ·冷冻电镜与三维重构技术 | 第32-33页 |
| ·HPV农壳蛋白及二十面体对称性原理 | 第33-34页 |
| 五、本研究的目的特点和意义 | 第34-36页 |
| 材料与方法 | 第36-63页 |
| 1.仪器 | 第36-37页 |
| 2.材料 | 第37-42页 |
| ·菌株、细胞株、质粒和引物 | 第37页 |
| ·大肠杆菌菌株 | 第37页 |
| ·质粒 | 第37页 |
| ·HPV18基因全长序列 | 第37页 |
| ·引物 | 第37页 |
| ·实验动物 | 第37页 |
| ·酶和单抗 | 第37页 |
| ·其他试剂 | 第37-38页 |
| ·常用溶液和培养基的配制 | 第38-42页 |
| ·LB培养基 | 第38页 |
| ·LB固体培养基 | 第38页 |
| ·氨苄青霉素储存液 | 第38页 |
| ·卡那霉素储备液 | 第38页 |
| ·选择性培养基 | 第38页 |
| ·碱法提取质粒溶液Ⅰ | 第38页 |
| ·碱法提取质粒溶液Ⅱ | 第38页 |
| ·碱法提取质粒溶液Ⅲ | 第38页 |
| ·Tris—饱和酚 | 第38-39页 |
| ·酚-氯仿-异戊醇(25:24:1) | 第39页 |
| ·TE缓冲液 | 第39页 |
| ·×TAE缓冲液 | 第39页 |
| ·DNA电泳凝胶加样缓冲液 | 第39页 |
| ·无DNA酶的RNA酶 | 第39页 |
| ·×蛋白加样缓冲液 | 第39页 |
| ·PBS | 第39页 |
| ·考马斯亮蓝染液 | 第39页 |
| ·裂解液 | 第39页 |
| ·蛋白SDS-PAGE试剂 | 第39-40页 |
| ·mol/L Tris-HCl(pH8.8) | 第39页 |
| ·mol/L Tris-HCl(pH6.8) | 第39页 |
| ·%SDS | 第39-40页 |
| ·%过硫酸铵 | 第40页 |
| ·Western blot用试剂 | 第40页 |
| ·转移缓冲液 | 第40页 |
| ·TN洗涤液 | 第40页 |
| ·封闭液(WB用) | 第40页 |
| ·TNT洗涤液 | 第40页 |
| ·HRP底物缓冲液 | 第40页 |
| ·EIA用试剂 | 第40-41页 |
| ·包被PB液 | 第40页 |
| ·封闭液(EIA用) | 第40页 |
| ·PBST | 第40页 |
| ·样品稀释液 | 第40-41页 |
| ·酶稀释液 | 第41页 |
| ·山羊标准血清 | 第41页 |
| ·兔抗羊HRP酶标抗体 | 第41页 |
| ·羊抗兔HRP酶标抗体 | 第41页 |
| ·单克隆抗体制备用试剂 | 第41-42页 |
| ·RPMI—1640培养液 | 第41页 |
| ·DMEM培养液 | 第41页 |
| ·HAT培养液 | 第41页 |
| ·HT培养液 | 第41-42页 |
| ·完全RPMI-1640液 | 第42页 |
| 3.方法 | 第42-63页 |
| ·PCR扩增反应 | 第42页 |
| ·小量质粒快速提取 | 第42-43页 |
| ·酶切方法 | 第43页 |
| ·胶回收Kit回收片段 | 第43页 |
| ·乙醇沉淀法回收线性质粒 | 第43-44页 |
| ·连接反应 | 第44页 |
| ·E.coli感受态细胞的制备 | 第44页 |
| ·连接产物的转化 | 第44页 |
| ·质粒DNA的转化 | 第44页 |
| ·酶切鉴定 | 第44-45页 |
| ·工程菌的小量诱导表达 | 第45页 |
| ·工程菌的大量诱导表达 | 第45页 |
| ·高压均质机的使用 | 第45-46页 |
| ·利用切向流装置改变缓冲液体系 | 第46页 |
| ·SDS-聚丙烯胺凝胶电泳(SDS—PAGE) | 第46页 |
| ·蛋白质免疫印迹法(Western Blotting) | 第46-47页 |
| ·AKTA色谱纯化 | 第47页 |
| ·分子筛层析分析 | 第47-48页 |
| ·动态光散射实验 | 第48页 |
| ·重组蛋白的透射电镜观察 | 第48页 |
| ·计算机辅助分析与设计 | 第48页 |
| ·疫苗原液的检定规程 | 第48-57页 |
| ·蛋白质含量测定操作规程 | 第48-50页 |
| ·蛋白质分子量测定操作规程 | 第50页 |
| ·蛋白质纯度检定操作规程 | 第50页 |
| ·蛋白质纯度检定——高效液相色谱法检定操作规程 | 第50-51页 |
| ·宿主菌蛋白残留量测定操作规程 | 第51-54页 |
| ·细菌内毒素检查检定操作规程 | 第54-56页 |
| ·残余抗生素活性检查检定操作规程 | 第56-57页 |
| ·紫外光谱测定操作规程 | 第57页 |
| ·小鼠免疫实验和采血 | 第57-58页 |
| ·小鼠单克隆抗体的筛选 | 第58-61页 |
| ·脾细胞的选择 | 第58页 |
| ·饲养细胞的处理 | 第58-59页 |
| ·细胞融合 | 第59-60页 |
| ·抗体检测 | 第60页 |
| ·克隆化过程 | 第60页 |
| ·单克隆抗体的制备 | 第60-61页 |
| ·单克隆抗体的纯化 | 第61页 |
| ·小鼠中和抗体的鉴定(假病毒中和实验) | 第61-62页 |
| ·中和抗体阻断实验 | 第62-63页 |
| ·EIA包板 | 第62页 |
| ·间接法EIA | 第62页 |
| ·单抗阻断抗血清实验 | 第62-63页 |
| 结果与分析 | 第63-108页 |
| 第一部分:HPV18疫苗的研制 | 第63-96页 |
| 1.HPV高效表达载体的构建 | 第63-65页 |
| ·HPV18全基因组DNA的提取 | 第63页 |
| ·非融合表达载体pTO-T7-HPV18N65C-L1的构建 | 第63-65页 |
| 2.HPV18L1纯化工艺的摸索及放大 | 第65-78页 |
| ·HPV18 L1的高密度发酵表达 | 第65-66页 |
| ·初纯工艺研究 | 第66-70页 |
| ·菌体破碎条件的摸索 | 第66-68页 |
| ·HPV18L1蛋白的硫酸铵沉淀纯化 | 第68-69页 |
| ·HPV-18 L1蛋白的硫铵沉淀吹溶条件的摸索 | 第69-70页 |
| ·HPV18 L1精纯条件的摸索 | 第70-78页 |
| ·刚离子交换层析 | 第70页 |
| ·层析介质选择 | 第70-71页 |
| ·样品上柱盐浓度的摸索 | 第71-72页 |
| ·不同pH条件下的纯化结果 | 第72-73页 |
| ·分步洗脱条件的确定 | 第73-74页 |
| ·工艺放大 | 第74-75页 |
| ·第二步柱层析 | 第75-77页 |
| ·工艺放大 | 第77-78页 |
| 3.HPV18 L1类病毒颗粒组装条件摸索 | 第78-81页 |
| ·实验设计 | 第79页 |
| ·复性方法及结果 | 第79-80页 |
| ·不同复性速度的情况 | 第80页 |
| ·工艺放大及回收率 | 第80-81页 |
| 4.HPV18疫苗原液检定 | 第81-96页 |
| ·无菌检查 | 第81页 |
| ·蛋白质含量 | 第81-82页 |
| ·分子量测定 | 第82-83页 |
| ·纯度 | 第83-85页 |
| ·电泳+免疫印迹法 | 第83-84页 |
| ·高效液相色谱(HPLC) | 第84-85页 |
| ·鉴别试验 | 第85-86页 |
| ·抗原含量测定 | 第86-87页 |
| ·宿主菌蛋白残留量 | 第87-88页 |
| ·DNA残留量测定 | 第88页 |
| ·肽图分析 | 第88-89页 |
| ·紫外光谱测定 | 第89-90页 |
| ·N-末端氨基酸序列测定 | 第90-91页 |
| ·细菌内毒素检查 | 第91页 |
| ·二硫苏糖醇(DTT)残余量检查 | 第91-92页 |
| ·Tween-80含量测定 | 第92页 |
| ·HPV18疫苗免疫原性检定 | 第92-96页 |
| ·重组人乳头瘤病毒疫苗免疫BALB/c小鼠的半数有效剂量(ED50)和免疫持久性 | 第93-94页 |
| ·抗原间接法测定 | 第93页 |
| ·细胞中和实验 | 第93-94页 |
| ·HPV18疫苗对恒河猴的免疫原性 | 第94-96页 |
| ·ELISA检测 | 第94-95页 |
| ·假病毒中和实验法检测 | 第95-96页 |
| 第二部分:HPV18中和单抗的鉴定 | 第96-103页 |
| 1.中和抗体优势表位的鉴定 | 第96-102页 |
| ·HPV18单克隆抗体的筛选 | 第96-98页 |
| ·中和抗体的筛选 | 第98页 |
| ·优势中和抗体的筛选 | 第98-102页 |
| ·间接法ELISA | 第98-99页 |
| ·单抗阻断山羊血清结合VLP实验 | 第99-100页 |
| ·单抗阻断兔血清结合VLP实验 | 第100-101页 |
| ·单抗互相阻断实验 | 第101-102页 |
| 2.HPV18 VLP与中和抗体11A9抗原抗体复合物的制备 | 第102-103页 |
| ·单克隆抗体HPV18 VLP-11A9 Fab复合物的制备 | 第102-103页 |
| ·A9 Fab的制备 | 第102页 |
| ·Fab-VLP复合物的制备 | 第102-103页 |
| 第三部分 HPV18 VLP冷冻电镜三维结构重建 | 第103-108页 |
| ·HPV18 VLP三维结构立体几何分析 | 第105-106页 |
| ·HPV18 VLP的对称性 | 第105页 |
| ·HPV18 VLP手性分析 | 第105-106页 |
| ·HPV18 VLP的结构分析 | 第106-108页 |
| 讨论 | 第108-117页 |
| 第一部分:HPV18 VLP疫苗的研制 | 第108-112页 |
| ·HPV18表达系统的确立 | 第108-109页 |
| ·HPV18纯化工艺的确立 | 第109-110页 |
| ·HPV18复性工艺的确立 | 第110-111页 |
| ·HPV18免疫保护性评价 | 第111-112页 |
| 第二部分:优势中和表位的鉴定 | 第112-114页 |
| ·HPV18中和单抗的鉴定 | 第112页 |
| ·HPV18优势中和单抗的研究 | 第112-114页 |
| ·HPV18优势中和单抗的评价 | 第112-114页 |
| ·HPV18优势表位的鉴定 | 第114页 |
| 第三部分、通过冷冻电镜及三维重建建立HPV18 VLP的三维模型 | 第114-117页 |
| ·HPV18 VLP三维结构分析 | 第115页 |
| ·解析精度的提高 | 第115-117页 |
| 小结与展望 | 第117-118页 |
| 参考文献 | 第118-128页 |
| 致谢 | 第128页 |
