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人乳头瘤病毒18型类病毒颗粒疫苗研制、中和抗体筛选及冷冻电镜三维结构重建

目录第1-10页
摘要第10-11页
ABSTRACT第11-12页
前言第12-36页
 一、HPV病毒概述及研究进展第12-22页
     ·HPV概述第12-13页
     ·人乳头瘤病毒的分子生物学特点第13-20页
       ·HPV的基因组及编码的蛋白第13-15页
       ·HPV颗粒的主要形态结构第15-17页
         ·HPV L1的主要抗原表位第16-17页
         ·HPV L2的主要抗原表位第17页
       ·HPV的感染和复制机制的研究第17-18页
       ·人乳头瘤病毒引发的相关疾病第18-20页
     ·HPV感染的分子生物学诊断第20-22页
       ·HPV DNA检测第21页
       ·HPV抗体检测第21-22页
 二、乳头瘤病毒感染模型第22-26页
     ·乳头瘤感染动物模型第22-23页
     ·HPV组织培养模型第23-24页
     ·转基因动物模型第24-25页
     ·HPV假病毒感染模型第25-26页
 三、人乳头瘤病毒疫苗的研究进展第26-31页
     ·HPV治疗性疫苗第26-27页
     ·HPV预防性疫苗第27-28页
       ·类病毒颗粒(VLP)疫苗第27-28页
     ·HPV预防性疫苗的研究现状第28-30页
     ·疫苗研制中不同的表达体系第30-31页
       ·真核表达系统第31页
       ·原核表达系统第31页
 四、生物大分子三维结构研究第31-34页
     ·X射线晶体学第32页
     ·核磁共振波谱学第32页
     ·冷冻电镜与三维重构技术第32-33页
     ·HPV农壳蛋白及二十面体对称性原理第33-34页
 五、本研究的目的特点和意义第34-36页
材料与方法第36-63页
 1.仪器第36-37页
 2.材料第37-42页
     ·菌株、细胞株、质粒和引物第37页
       ·大肠杆菌菌株第37页
       ·质粒第37页
       ·HPV18基因全长序列第37页
       ·引物第37页
       ·实验动物第37页
     ·酶和单抗第37页
     ·其他试剂第37-38页
     ·常用溶液和培养基的配制第38-42页
       ·LB培养基第38页
       ·LB固体培养基第38页
       ·氨苄青霉素储存液第38页
       ·卡那霉素储备液第38页
       ·选择性培养基第38页
       ·碱法提取质粒溶液Ⅰ第38页
       ·碱法提取质粒溶液Ⅱ第38页
       ·碱法提取质粒溶液Ⅲ第38页
       ·Tris—饱和酚第38-39页
       ·酚-氯仿-异戊醇(25:24:1)第39页
       ·TE缓冲液第39页
       ·×TAE缓冲液第39页
       ·DNA电泳凝胶加样缓冲液第39页
       ·无DNA酶的RNA酶第39页
       ·×蛋白加样缓冲液第39页
       ·PBS第39页
       ·考马斯亮蓝染液第39页
       ·裂解液第39页
       ·蛋白SDS-PAGE试剂第39-40页
           ·mol/L Tris-HCl(pH8.8)第39页
           ·mol/L Tris-HCl(pH6.8)第39页
         ·%SDS第39-40页
         ·%过硫酸铵第40页
       ·Western blot用试剂第40页
         ·转移缓冲液第40页
         ·TN洗涤液第40页
         ·封闭液(WB用)第40页
         ·TNT洗涤液第40页
         ·HRP底物缓冲液第40页
       ·EIA用试剂第40-41页
         ·包被PB液第40页
         ·封闭液(EIA用)第40页
         ·PBST第40页
         ·样品稀释液第40-41页
         ·酶稀释液第41页
         ·山羊标准血清第41页
         ·兔抗羊HRP酶标抗体第41页
         ·羊抗兔HRP酶标抗体第41页
       ·单克隆抗体制备用试剂第41-42页
         ·RPMI—1640培养液第41页
         ·DMEM培养液第41页
         ·HAT培养液第41页
         ·HT培养液第41-42页
         ·完全RPMI-1640液第42页
 3.方法第42-63页
     ·PCR扩增反应第42页
     ·小量质粒快速提取第42-43页
     ·酶切方法第43页
     ·胶回收Kit回收片段第43页
     ·乙醇沉淀法回收线性质粒第43-44页
     ·连接反应第44页
     ·E.coli感受态细胞的制备第44页
     ·连接产物的转化第44页
     ·质粒DNA的转化第44页
     ·酶切鉴定第44-45页
     ·工程菌的小量诱导表达第45页
     ·工程菌的大量诱导表达第45页
     ·高压均质机的使用第45-46页
     ·利用切向流装置改变缓冲液体系第46页
     ·SDS-聚丙烯胺凝胶电泳(SDS—PAGE)第46页
     ·蛋白质免疫印迹法(Western Blotting)第46-47页
     ·AKTA色谱纯化第47页
     ·分子筛层析分析第47-48页
     ·动态光散射实验第48页
     ·重组蛋白的透射电镜观察第48页
     ·计算机辅助分析与设计第48页
     ·疫苗原液的检定规程第48-57页
       ·蛋白质含量测定操作规程第48-50页
       ·蛋白质分子量测定操作规程第50页
       ·蛋白质纯度检定操作规程第50页
       ·蛋白质纯度检定——高效液相色谱法检定操作规程第50-51页
       ·宿主菌蛋白残留量测定操作规程第51-54页
       ·细菌内毒素检查检定操作规程第54-56页
       ·残余抗生素活性检查检定操作规程第56-57页
       ·紫外光谱测定操作规程第57页
     ·小鼠免疫实验和采血第57-58页
     ·小鼠单克隆抗体的筛选第58-61页
       ·脾细胞的选择第58页
       ·饲养细胞的处理第58-59页
       ·细胞融合第59-60页
       ·抗体检测第60页
       ·克隆化过程第60页
       ·单克隆抗体的制备第60-61页
       ·单克隆抗体的纯化第61页
     ·小鼠中和抗体的鉴定(假病毒中和实验)第61-62页
     ·中和抗体阻断实验第62-63页
       ·EIA包板第62页
       ·间接法EIA第62页
       ·单抗阻断抗血清实验第62-63页
结果与分析第63-108页
 第一部分:HPV18疫苗的研制第63-96页
  1.HPV高效表达载体的构建第63-65页
     ·HPV18全基因组DNA的提取第63页
     ·非融合表达载体pTO-T7-HPV18N65C-L1的构建第63-65页
  2.HPV18L1纯化工艺的摸索及放大第65-78页
     ·HPV18 L1的高密度发酵表达第65-66页
     ·初纯工艺研究第66-70页
       ·菌体破碎条件的摸索第66-68页
       ·HPV18L1蛋白的硫酸铵沉淀纯化第68-69页
       ·HPV-18 L1蛋白的硫铵沉淀吹溶条件的摸索第69-70页
     ·HPV18 L1精纯条件的摸索第70-78页
       ·刚离子交换层析第70页
       ·层析介质选择第70-71页
       ·样品上柱盐浓度的摸索第71-72页
       ·不同pH条件下的纯化结果第72-73页
       ·分步洗脱条件的确定第73-74页
       ·工艺放大第74-75页
       ·第二步柱层析第75-77页
       ·工艺放大第77-78页
  3.HPV18 L1类病毒颗粒组装条件摸索第78-81页
     ·实验设计第79页
     ·复性方法及结果第79-80页
     ·不同复性速度的情况第80页
     ·工艺放大及回收率第80-81页
  4.HPV18疫苗原液检定第81-96页
     ·无菌检查第81页
     ·蛋白质含量第81-82页
     ·分子量测定第82-83页
     ·纯度第83-85页
       ·电泳+免疫印迹法第83-84页
       ·高效液相色谱(HPLC)第84-85页
     ·鉴别试验第85-86页
     ·抗原含量测定第86-87页
     ·宿主菌蛋白残留量第87-88页
     ·DNA残留量测定第88页
     ·肽图分析第88-89页
     ·紫外光谱测定第89-90页
     ·N-末端氨基酸序列测定第90-91页
     ·细菌内毒素检查第91页
     ·二硫苏糖醇(DTT)残余量检查第91-92页
     ·Tween-80含量测定第92页
     ·HPV18疫苗免疫原性检定第92-96页
       ·重组人乳头瘤病毒疫苗免疫BALB/c小鼠的半数有效剂量(ED50)和免疫持久性第93-94页
         ·抗原间接法测定第93页
         ·细胞中和实验第93-94页
       ·HPV18疫苗对恒河猴的免疫原性第94-96页
         ·ELISA检测第94-95页
         ·假病毒中和实验法检测第95-96页
 第二部分:HPV18中和单抗的鉴定第96-103页
  1.中和抗体优势表位的鉴定第96-102页
     ·HPV18单克隆抗体的筛选第96-98页
     ·中和抗体的筛选第98页
     ·优势中和抗体的筛选第98-102页
       ·间接法ELISA第98-99页
       ·单抗阻断山羊血清结合VLP实验第99-100页
       ·单抗阻断兔血清结合VLP实验第100-101页
       ·单抗互相阻断实验第101-102页
  2.HPV18 VLP与中和抗体11A9抗原抗体复合物的制备第102-103页
     ·单克隆抗体HPV18 VLP-11A9 Fab复合物的制备第102-103页
       ·A9 Fab的制备第102页
       ·Fab-VLP复合物的制备第102-103页
 第三部分 HPV18 VLP冷冻电镜三维结构重建第103-108页
     ·HPV18 VLP三维结构立体几何分析第105-106页
       ·HPV18 VLP的对称性第105页
       ·HPV18 VLP手性分析第105-106页
     ·HPV18 VLP的结构分析第106-108页
讨论第108-117页
 第一部分:HPV18 VLP疫苗的研制第108-112页
     ·HPV18表达系统的确立第108-109页
     ·HPV18纯化工艺的确立第109-110页
     ·HPV18复性工艺的确立第110-111页
     ·HPV18免疫保护性评价第111-112页
 第二部分:优势中和表位的鉴定第112-114页
     ·HPV18中和单抗的鉴定第112页
     ·HPV18优势中和单抗的研究第112-114页
       ·HPV18优势中和单抗的评价第112-114页
       ·HPV18优势表位的鉴定第114页
 第三部分、通过冷冻电镜及三维重建建立HPV18 VLP的三维模型第114-117页
     ·HPV18 VLP三维结构分析第115页
     ·解析精度的提高第115-117页
小结与展望第117-118页
参考文献第118-128页
致谢第128页

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