| 摘要 | 第1-10页 |
| ABSTRACT | 第10-14页 |
| 1 文献综述 | 第14-44页 |
| ·单核细胞增生李斯特菌生物学特性 | 第14-23页 |
| ·基本特征 | 第14-15页 |
| ·分布 | 第15-16页 |
| ·生活周期 | 第16-17页 |
| ·对理化因素的抵抗力 | 第17页 |
| ·血清学分型 | 第17-18页 |
| ·主要毒力因子 | 第18-22页 |
| ·李斯特菌病的临床特征 | 第22页 |
| ·李斯特菌病的暴发情况 | 第22-23页 |
| ·单核细胞增生李斯特菌检测技术 | 第23-34页 |
| ·生化鉴定技术 | 第23-25页 |
| ·免疫学检测技术 | 第25-27页 |
| ·核酸分子杂交检测技术 | 第27-28页 |
| ·PCR检测技术 | 第28-34页 |
| ·荧光定量PCR的原理和分类 | 第34-37页 |
| ·原理 | 第34-35页 |
| ·分类 | 第35-37页 |
| ·存在的缺点 | 第37页 |
| ·扩增内标的研究概况 | 第37-43页 |
| ·导致假阴性出现的原因 | 第37-40页 |
| ·扩增内标在PCR检测中的应用 | 第40-41页 |
| ·扩增内标的制备方法 | 第41-43页 |
| ·研究目标 | 第43-44页 |
| 2 单核细胞增生李斯特菌的鉴定与验证 | 第44-59页 |
| ·材料与方法 | 第44-55页 |
| ·菌株 | 第44-45页 |
| ·培养基 | 第45页 |
| ·主要试剂及配制 | 第45-46页 |
| ·主要仪器设备 | 第46页 |
| ·菌株的培养和革兰氏染色 | 第46页 |
| ·Biolog细菌鉴定系统 | 第46-48页 |
| ·VITEK-32全自动微生物鉴定/药物分析系统 | 第48-50页 |
| ·BD BBL Crystal细菌鉴定系统 | 第50-52页 |
| ·基于PCR技术的细菌鉴定方法 | 第52-53页 |
| ·血清学鉴定 | 第53-55页 |
| ·结果与分析 | 第55-58页 |
| ·Biolog鉴定结果 | 第55页 |
| ·VITEK-32鉴定结果 | 第55页 |
| ·BD BBL Crystall鉴定结果 | 第55-56页 |
| ·PCR方法鉴定结果 | 第56页 |
| ·各种鉴定方法的比较 | 第56-57页 |
| ·血清学鉴定结果 | 第57-58页 |
| ·讨论 | 第58-59页 |
| 3 单核细胞增生李斯特菌活菌内标序列的设计与合成 | 第59-74页 |
| ·材料与方法 | 第59-66页 |
| ·菌种和质粒 | 第59-60页 |
| ·培养基及试剂的配制 | 第60页 |
| ·仪器和设备 | 第60-61页 |
| ·hly基因的保守区段分析 | 第61页 |
| ·特异性检测引物与探针的设计 | 第61页 |
| ·扩增内标序列的设计 | 第61-62页 |
| ·扩增内标序列的合成 | 第62-64页 |
| ·扩增内标序列与载体连接 | 第64-65页 |
| ·感受态细胞的制备 | 第65页 |
| ·连接产物的转化 | 第65页 |
| ·阳性转化子的筛选 | 第65页 |
| ·质粒的提取 | 第65-66页 |
| ·阳性克隆的测序鉴定 | 第66页 |
| ·结果与分析 | 第66-71页 |
| ·hly基因序列比对结果 | 第66-69页 |
| ·引物与探针的合成 | 第69页 |
| ·扩增内标序列的筛选结果 | 第69-70页 |
| ·扩增内标序列的PCR检测 | 第70-71页 |
| ·阳性克隆片段的序列测定 | 第71页 |
| ·讨论 | 第71-74页 |
| 4 带有内标序列的单核细胞增生李斯特菌突变株的构建 | 第74-101页 |
| ·材料与方法 | 第74-91页 |
| ·菌株 | 第74页 |
| ·培养基 | 第74-75页 |
| ·质粒 | 第75-77页 |
| ·主要试剂及溶液的配制 | 第77-78页 |
| ·主要仪器设备 | 第78-79页 |
| ·DNA模板的提取 | 第79页 |
| ·引物的设计与合成 | 第79-80页 |
| ·PCR扩增 | 第80-81页 |
| ·PCR产物及载体的酶切、回收与纯化 | 第81-82页 |
| ·DNA片断的连接 | 第82页 |
| ·感受态细胞的制备 | 第82-83页 |
| ·连接产物的转化 | 第83页 |
| ·重组质粒的快速鉴定 | 第83页 |
| ·质粒的提取 | 第83-84页 |
| ·重组质粒的酶切鉴定 | 第84页 |
| ·同源重组质粒pKSV7-UIKD的构建 | 第84-86页 |
| ·单核细胞增生李斯特菌感受态细胞的制备 | 第86页 |
| ·电转单核细胞增生李斯特菌感受态细胞 | 第86页 |
| ·质粒的提取 | 第86-87页 |
| ·阳性转化子的菌落PCR及酶切鉴定 | 第87页 |
| ·同源交换突变株的筛选 | 第87-89页 |
| ·同源交换突变株的PCR鉴定 | 第89-90页 |
| ·同源交换突变株的RT-PCR鉴定 | 第90-91页 |
| ·突变株内标序列的测序分析 | 第91页 |
| ·结果与分析 | 第91-99页 |
| ·hly基因上游和下游同源片段的PCR扩增 | 第91-92页 |
| ·中间质粒pSK-UIKD的构建 | 第92-94页 |
| ·同源重组质粒pKSV7-UIKD的构建 | 第94-95页 |
| ·质粒pKSV7-UIKD的酶切鉴定 | 第95页 |
| ·同源交换突变株的获得 | 第95-96页 |
| ·同源交换突变株的PCR验证结果 | 第96-97页 |
| ·同源交换突变株的RT-PCR验证结果 | 第97-98页 |
| ·突变株内标序列的测序分析结果 | 第98-99页 |
| ·讨论 | 第99-101页 |
| ·同源重组质粒pKSV7-UIKD的构建 | 第99页 |
| ·同源重组质粒pKSV7-UIKD的电转化 | 第99-100页 |
| ·同源交换突变株的筛选与鉴定 | 第100-101页 |
| 5 添加活菌内标的荧光定量PCR检测方法的研究 | 第101-128页 |
| ·材料与方法 | 第101-110页 |
| ·菌株 | 第101-102页 |
| ·培养基 | 第102-103页 |
| ·主要试剂 | 第103页 |
| ·主要仪器设备 | 第103页 |
| ·菌种活化与培养 | 第103-104页 |
| ·基因组DNA提取 | 第104页 |
| ·含扩增内标荧光定量PCR检测方法的建立 | 第104-106页 |
| ·含扩增内标荧光定量PCR检测方法的评价 | 第106页 |
| ·活菌内标在准确定量中的运用(LM-IAC AQ-PCR) | 第106-108页 |
| ·活菌内标在全程监控假阴性中的运用(LM-IAC EQ-PCR) | 第108-110页 |
| ·结果与分析 | 第110-125页 |
| ·荧光阈值的设定 | 第110页 |
| ·TaqMan探针浓度的选择 | 第110页 |
| ·活菌内标添加量的确定 | 第110-111页 |
| ·特异性评价 | 第111-112页 |
| ·灵敏度评价 | 第112-113页 |
| ·DNA提取方法的选择 | 第113-115页 |
| ·野生菌和活菌内标PCR扩增效率的评价 | 第115-116页 |
| ·野生菌和活菌内标DNA提取效率的评价 | 第116-118页 |
| ·回归方程的建立 | 第118-119页 |
| ·LM-IAC AQ-PCR定量方法的评价 | 第119-120页 |
| ·野生菌与活菌内标生化特性比较 | 第120页 |
| ·野生菌和活菌内标生长曲线的测定 | 第120-121页 |
| ·混合培养中活菌内标平板计数卡那霉素加入量的确定 | 第121-122页 |
| ·混合培养中活菌内标加入量对野生菌生长的影响 | 第122-123页 |
| ·LM-IAC EQ-PCR全程监控假阴性的评价 | 第123-125页 |
| ·讨论 | 第125-128页 |
| ·活菌内标在单核细胞增生李斯特菌准确定量中的运用 | 第125-126页 |
| ·活菌内标在荧光定量PCR检测中全程监控假阴性的运用 | 第126-128页 |
| 6 添加多重扩增内标的PCR检测方法的建立 | 第128-145页 |
| ·材料与方法 | 第128-133页 |
| ·供试菌株 | 第128-129页 |
| ·培养基及试剂的配制 | 第129页 |
| ·仪器和设备 | 第129-130页 |
| ·DNA模板的提取和定量 | 第130页 |
| ·含多重扩增内标的PCR检测方法(mIAC PCR)的建立 | 第130-132页 |
| ·PCR结果的电泳检测 | 第132页 |
| ·mIAC PCR检测方法的评价 | 第132-133页 |
| ·结果与分析 | 第133-143页 |
| ·多重内标的PCR验证 | 第133页 |
| ·未添加多重扩增内标时的纯DNA检测灵敏度 | 第133-135页 |
| ·添加有多重扩增内标时的纯DNA检测灵敏度 | 第135-136页 |
| ·mIAC PCR检测方法特异性评价 | 第136-140页 |
| ·人工污染样品的检测 | 第140-143页 |
| ·讨论 | 第143-145页 |
| 7 结论及创新性 | 第145-146页 |
| ·结论 | 第145页 |
| ·特色和创新 | 第145-146页 |
| 参考文献 | 第146-159页 |
| 致谢 | 第159-160页 |
| 附录 | 第160页 |
