| 致谢 | 第1-7页 |
| 摘要 | 第7-9页 |
| Abstract | 第9-11页 |
| 目次 | 第11-14页 |
| 1 引言 | 第14-45页 |
| ·双生病毒与伴随的小分子 DNA | 第14-23页 |
| ·双生病毒的特性 | 第15-17页 |
| ·双生病毒科的分类 | 第15-16页 |
| ·Begomovirus 的基因组结构和功能 | 第16-17页 |
| ·单组份 begomoviruses 伴随卫星 DNAβ的发现 | 第17-19页 |
| ·Nanovirus 类小分子的发现 | 第19-21页 |
| ·DNA1的基因组结构 | 第20-21页 |
| ·DNA1的生物学功能 | 第21页 |
| ·DNA1与 begomovirus/DNAβ形成一种新型的病害复合体 | 第21-22页 |
| ·DNA1与 begomovirus/DNAβ的进化关系 | 第22-23页 |
| ·病毒诱导的基因沉默及其在功能基因组研究中的应用 | 第23-45页 |
| ·引言 | 第23-25页 |
| ·VIGS 的建立与发展 | 第25-30页 |
| ·VIGS 的机制 | 第30-34页 |
| ·VIGS 的方法学及改进 | 第34-35页 |
| ·利用 VIGS 对植物中不同器官和组织中进行功能基因研究的进展 | 第35-43页 |
| ·细胞功能 | 第35-36页 |
| ·植物发育 | 第36页 |
| ·代谢途径 | 第36-37页 |
| ·抗病性相关的基因 | 第37-38页 |
| ·非生物逆境 | 第38-43页 |
| ·VIGS 的优势 | 第43-44页 |
| ·VIGS 的局限性 | 第44页 |
| ·结论和展望 | 第44-45页 |
| 2 基于双生病毒 DNA1载体的 VIGS 体系的建立 | 第45-78页 |
| ·材料与方法 | 第45-56页 |
| ·病毒和植物材料 | 第45-46页 |
| ·载体构建 | 第46页 |
| ·目的基因的克隆和含目的基因的沉默载体的构建 | 第46-47页 |
| ·电击转化农杆菌 | 第47-48页 |
| ·农杆菌介导的植株接种 | 第48-49页 |
| ·植物总 DNA 提取和 Southern 分析 | 第49-51页 |
| ·总 DNA 提取(CTAB 法) | 第49页 |
| ·电泳及转膜 | 第49-50页 |
| ·探针标记(地高辛) | 第50页 |
| ·预杂交和杂交 | 第50-51页 |
| ·大量提取 RNA 和 Northern 印迹分析 | 第51-55页 |
| ·器皿和容器的处理 | 第51页 |
| ·植物总 RNA 的提取 | 第51页 |
| ·大小 RNA 的分离 | 第51-52页 |
| ·探针标记 | 第52页 |
| ·大 RNA 的甲醛变性凝胶电泳 | 第52-53页 |
| ·大 RNA 的转膜 | 第53页 |
| ·大 RNA 的预杂交和杂交 | 第53-54页 |
| ·小 RNA 的尿素变性电泳 | 第54页 |
| ·小 RNA 的转膜 | 第54页 |
| ·小 RNA 的预杂交和杂交 | 第54-55页 |
| ·Real time PCR 检测植物基因的表达量 | 第55-56页 |
| ·GFP 荧光检测与成像 | 第56页 |
| ·GUS 染色 | 第56页 |
| ·结果与分析 | 第56-75页 |
| ·沉默载体的构建 | 第56-58页 |
| ·DNA1沉默载体和同源辅助病毒 TbCSV 能引起植物 VIGS | 第58-63页 |
| ·同源辅助病毒 TbCSV 支持 DNA1沉默载体的复制 | 第58页 |
| ·DNA1沉默载体与同源辅助病毒能引起转基因植物的基因沉默 | 第58-60页 |
| ·DNA1沉默载体与同源辅助病毒能引起植物内源基因的沉默 | 第60-62页 |
| ·DNA1沉默载体与同源辅助病毒能在多种植物中引起 VIGS | 第62-63页 |
| ·异源辅助病毒 TYLCCNV 能支持沉默载体的复制,并引起植物基因沉默 | 第63-70页 |
| ·异源辅助病毒 TYLCCNV 能支持 DNA1沉默载体的复制 | 第63-64页 |
| ·DNA1沉默载体与异源辅助病毒能引起转基因植物的基因沉默 | 第64页 |
| ·DNA1沉默载体与异源辅助病毒能引起植物内源基因的沉默 | 第64-65页 |
| ·DNA1沉默载体与异源辅助病毒能在多种植物中引起 VIGS | 第65-66页 |
| ·2mDNA1载体抑制花组织功能基因的表达 | 第66页 |
| ·DNA1沉默载体诱导胚胎致死基因 PCNA 发生沉默 | 第66-67页 |
| ·2mDNA1载体同时沉默两个基因 | 第67-69页 |
| ·2mDNA1载体插入片段长度与基因沉默的效率 | 第69-70页 |
| ·2mDNA1和 TbCSV 在普通烟中沉默体系的优化 | 第70-75页 |
| ·TbCSV 和2mDNA1能在转基因植株中诱导沉默 | 第70-71页 |
| ·TbCSV 和2mDNA1能持久、高效的在普通烟中诱导内源基因沉默 | 第71-73页 |
| ·TbCSV 和2mDNA1能够在多个普通烟品种中诱导高效沉默 | 第73页 |
| ·不同龄期接种 TbCSV 和2mDNA1均能够诱导高效沉默 | 第73-74页 |
| ·TbCSV 和2mDNA1诱导的高效沉默是温度不敏感的 | 第74-75页 |
| ·讨论 | 第75-78页 |
| 3 利用 DNA1沉默载体进行植物功能基因研究 | 第78-102页 |
| ·材料与方法 | 第78-84页 |
| ·材料 | 第78页 |
| ·载体构建 | 第78-80页 |
| ·沉默重组质粒的构建 | 第78页 |
| ·酵母表达载体的构建 | 第78-79页 |
| ·植物表达载体的构建 | 第79-80页 |
| ·接种供试植株 | 第80-81页 |
| ·TMV:GFP 浸润和 TMV 摩擦接种攻毒 | 第81页 |
| ·Real time PCR 检测植物基因的表达量 | 第81-82页 |
| ·TAS-ELISA | 第82页 |
| ·Northern blot 分析 | 第82-83页 |
| ·Overlap Extension PCR | 第83页 |
| ·质粒转化酵母菌 | 第83-84页 |
| ·共聚焦显微镜观察 | 第84页 |
| ·本氏烟中 TOM 类基因是 TMV 复制的寄主因子 | 第84-88页 |
| ·结果和分析 | 第85-87页 |
| ·沉默载体在本氏烟中高效的沉默目的基因 | 第85页 |
| ·NbTOMI和bNTO几尽的沉默降低了TMv的复制 | 第85-87页 |
| ·讨论 | 第87-88页 |
| ·NtEDS1是 N 基因介导的 HR 中的重要因子 | 第88-92页 |
| ·结果和分析 | 第89-90页 |
| ·沉默载体在本氏烟中高效的沉默目的基因 | 第89页 |
| ·NtEDS1沉默使得 N 基因能够介导的 TMV 不能产生 HR 反应 | 第89-90页 |
| ·讨论 | 第90-92页 |
| ·叶发育相关 NbPHAN 基因功能的初步研究 | 第92-102页 |
| ·结果和分析 | 第92-100页 |
| ·NbPHAN 基因的克隆和序列分析 | 第92-93页 |
| ·抑制 NbPHAN 的表达严重影响叶片发育 | 第93-95页 |
| ·NbPHAN 能和 AtAS2互作 | 第95-97页 |
| ·NbFHAN 的中间区域(MD)决定了与 AtAS2的互作 | 第97-98页 |
| ·NbPHAN 能自我形成复合体,并且 CTD 区域决定了这种特性 | 第98-99页 |
| ·NbPHAN 定位于细胞核内,MYB 区域决定了这种定位 | 第99-100页 |
| ·讨论 | 第100-102页 |
| 4 全文小结 | 第102-104页 |
| 参考文献 | 第104-120页 |
| 附录 A 本论文中所用术语缩写与中英文对照 | 第120-121页 |
| 附录 B 本论文所用病毒缩写及中英文对照 | 第121-122页 |
| 附录 C 常用生化及分子生物学试剂与仪器 | 第122-123页 |
| 附录 D 常用缓冲液及培养基配方 | 第123-126页 |
| 在学期间所取得的科研成果 | 第126页 |
