| 摘要 | 第1-11页 |
| ABSTRACT | 第11-13页 |
| 缩略词表 | 第13-14页 |
| 文献综述 | 第14-37页 |
| 1 植物microRNA | 第14-28页 |
| ·植物miRNA的生物合成 | 第14-17页 |
| ·植物miRNA生物合成步骤 | 第14-15页 |
| ·miRNA合成过程中的关键蛋白 | 第15-17页 |
| ·植物中其它小分子RNA | 第17-19页 |
| ·TasiRNA | 第17页 |
| ·Nat-siRNA | 第17-18页 |
| ·LsiRNA | 第18页 |
| ·Nat-miRNA | 第18-19页 |
| ·Hc-siRNA | 第19页 |
| ·植物miRNA的功能 | 第19-28页 |
| ·调控植物发育 | 第19-21页 |
| ·miRNA在胁迫下的调控作用 | 第21-24页 |
| ·营养元素平衡 | 第24-26页 |
| ·胁迫响应miRNA是如何调控的 | 第26-27页 |
| ·发育因素和胁迫因子对miRNA的共调节 | 第27-28页 |
| 2 镉对植物的生物学毒性 | 第28-32页 |
| ·镉对植物的毒害作用 | 第28-30页 |
| ·对光合作用的影响 | 第28页 |
| ·对营养元素吸收的影响 | 第28页 |
| ·胁迫导致植物自由基的过氧化损伤 | 第28-30页 |
| ·植物对镉毒害的耐性机理 | 第30-32页 |
| ·基因表达模式的改变 | 第30-31页 |
| ·植物螯合肽 | 第31页 |
| ·金属硫蛋白 | 第31-32页 |
| 3 硫的代谢合成 | 第32-34页 |
| ·硫酸盐的吸收和转运 | 第32-33页 |
| ·硫酸盐的活化 | 第33页 |
| ·硫酸盐的还原 | 第33页 |
| ·Cys的合成 | 第33-34页 |
| 4 本研究的目的和意义 | 第34-37页 |
| 第一章 水稻中对重金属胁迫响应的miRNA克隆与分析 | 第37-64页 |
| 1 前言 | 第37页 |
| 2 材料与方法 | 第37-48页 |
| ·试剂、材料培养与处理 | 第37-40页 |
| ·植物材料 | 第37页 |
| ·材料培养 | 第37页 |
| ·重金属胁迫处理 | 第37-38页 |
| ·水稻营养液(pH=5.5) | 第38页 |
| ·缓冲液 | 第38页 |
| ·文库构建试剂 | 第38-40页 |
| ·表达所用引物 | 第40页 |
| ·水稻中受重金属胁迫响应的小分子RNA文库的构建 | 第40-45页 |
| ·小RNA提取 | 第40-41页 |
| ·小分子RNA加尾 | 第41页 |
| ·小分子RNA加尾产物加5’接头 | 第41-42页 |
| ·PCR富集cDNA文库 | 第42-43页 |
| ·PAGE胶中回收DNA | 第43页 |
| ·目的片段与载体连接 | 第43页 |
| ·目的片段转化及鉴定 | 第43-45页 |
| ·生物信息学方法分析测序结果 | 第45-47页 |
| ·测序结果分析 | 第45页 |
| ·分析方法和途径 | 第45-47页 |
| ·miRNA与其靶基因的表达分析 | 第47-48页 |
| 3 结果与讨论 | 第48-61页 |
| ·水稻中受重金属胁迫响应的小分子RNA文库的构建 | 第48-49页 |
| ·新发现的水稻miRNA特征 | 第49-55页 |
| ·克隆到的已知miRNA | 第55页 |
| ·其它内源性非编码小RNA | 第55-56页 |
| ·水稻中miRNA靶基因的预测 | 第56-57页 |
| ·新miRNA在重金属胁迫下的表达模式 | 第57-59页 |
| ·文库克隆到的已知miRNA在重金属胁迫下的表达模式 | 第59-61页 |
| ·靶基因的表达与分析 | 第61页 |
| 4 讨论 | 第61-64页 |
| 第二章 油菜缺硫及镉调控的miRNA克隆与分析 | 第64-78页 |
| 1 前言 | 第64页 |
| 2 材料与方法 | 第64-68页 |
| ·材料与处理 | 第64-65页 |
| ·材料与培养 | 第64页 |
| ·材料处理 | 第64-65页 |
| ·直接克隆法分离和鉴定miRNA | 第65-66页 |
| ·试剂与试剂盒 | 第65-66页 |
| ·miRNA克隆 | 第66页 |
| ·生物信息学方法分析测序结果 | 第66页 |
| ·油菜靶基因5’RACE分析切割位点 | 第66-68页 |
| ·油菜总RNA的提取 | 第66页 |
| ·总RNA定量与完整性检测 | 第66-67页 |
| ·RACE | 第67页 |
| ·5’RACE接头的连接 | 第67页 |
| ·反转录 | 第67页 |
| ·5’RLM-RACE PCR | 第67-68页 |
| ·5’RLM-RACE巢式PCR | 第68页 |
| ·目的条带回收,转化,测序 | 第68页 |
| ·miRNA和其靶基因表达 | 第68页 |
| 3 结果与分析 | 第68-75页 |
| ·文库测序结果与分析 | 第68-69页 |
| ·Bn-miR395靶基因的预测、克隆和功能分析 | 第69-71页 |
| ·RACE分析Bn-miR395的剪切位点 | 第71-72页 |
| ·Bn-miR395调控油菜缺硫与镉胁迫反应 | 第72-73页 |
| ·油菜miR395过表达植株 | 第73-75页 |
| 4 讨论 | 第75-78页 |
| 第三章 miR395对缺硫胁迫反应的功能鉴定与分析 | 第78-96页 |
| 1 前言 | 第78-79页 |
| 2 材料与方法 | 第79-88页 |
| ·材料与试剂 | 第79-81页 |
| ·植物材料 | 第79页 |
| ·质粒及菌株 | 第79页 |
| ·材料培养 | 第79页 |
| ·GM培养基培养 | 第79页 |
| ·缺硫处理 | 第79页 |
| ·拟南芥GM培养基相关试剂 | 第79-80页 |
| ·转基因相关试剂 | 第80页 |
| ·载体构建相关试剂 | 第80-81页 |
| ·Northern相关试剂 | 第81页 |
| ·拟南芥miR395过表达载体的构建 | 第81-83页 |
| ·拟南芥总DNA的提取 | 第81-82页 |
| ·PCR扩增拟南芥miR395c、miR395e前体基因 | 第82页 |
| ·目的片段的回收 | 第82页 |
| ·目的片段与pMD19-T载体的连接 | 第82页 |
| ·转入大肠杆菌 | 第82页 |
| ·质粒的提取 | 第82-83页 |
| ·酶切目的片段 | 第83页 |
| ·目的片段链接至pBI121表达载体 | 第83页 |
| ·SULTR2;1_(PRO)::SULTR2;1:GFP和SULTR2;1_(PRO)::SULTR2;1_(mutant):GFP载体构建 | 第83-84页 |
| ·拟南芥总RNA的提取 | 第83页 |
| ·拟南芥cDNA模板合成 | 第83页 |
| ·PCR扩增拟南芥SULTR2;1基因和SULTR2;1启动子 | 第83页 |
| ·SULTR2;1基因与miR395的互补位点突变 | 第83-84页 |
| ·目的片段的回收 | 第84页 |
| ·目的片段与pMD19-T载体的连接 | 第84页 |
| ·转入大肠杆菌 | 第84页 |
| ·PCR扩增及质粒的提取 | 第84页 |
| ·目的片段链接至表达载体pBI101 | 第84页 |
| ·拟南芥转化 | 第84-85页 |
| ·转入农杆菌 | 第84-85页 |
| ·侵染 | 第85页 |
| ·卡那霉素筛选 | 第85页 |
| ·Northern方法与步骤 | 第85-87页 |
| ·总RNA提取 | 第85页 |
| ·RNA样品的制备 | 第85页 |
| ·电泳分离 | 第85页 |
| ·转膜 | 第85-86页 |
| ·探针的制备 | 第86页 |
| ·预杂交 | 第86页 |
| ·杂交 | 第86-87页 |
| ·洗膜 | 第87页 |
| ·曝光 | 第87页 |
| ·QPCR验证基因表达 | 第87页 |
| ·转基因植物GFP成像 | 第87-88页 |
| 3 结果与分析 | 第88-94页 |
| ·拟南芥5种不同基因型的表型 | 第88-89页 |
| ·miR395表达模式 | 第89-90页 |
| ·miR395靶基因表达 | 第90-92页 |
| ·miR395调控SULTR2;1模式分析 | 第92-94页 |
| 4 讨论 | 第94-96页 |
| 全文小结 | 第96-98页 |
| 创新点 | 第98-100页 |
| 存在问题和工作展望 | 第100-102页 |
| 参考文献 | 第102-116页 |
| 攻读学位期间发表的论文 | 第116-118页 |
| 致谢 | 第118页 |
