| 摘要 | 第9-11页 |
| Abstract | 第11-12页 |
| 第一章 引言 | 第13-21页 |
| 1.1 乳糖酶的分子结构与作用机制 | 第13-14页 |
| 1.2 乳糖酶的来源 | 第14-15页 |
| 1.2.1 霉菌来源的乳糖酶 | 第14页 |
| 1.2.2 细菌来源的乳糖酶 | 第14-15页 |
| 1.2.3 酵母菌来源的乳糖酶 | 第15页 |
| 1.3 乳糖酶的应用 | 第15-17页 |
| 1.3.1 治疗乳糖不耐受症 | 第15-16页 |
| 1.3.2 在乳制品加工工业上的应用 | 第16-17页 |
| 1.3.3 应用于生产低聚半乳糖 | 第17页 |
| 1.4 基因工程技术在乳糖酶生产中的应用 | 第17-18页 |
| 1.5 乳酸克鲁维酵母表达系统 | 第18-19页 |
| 1.6 本研究的主要内容及意义 | 第19-21页 |
| 1.6.1 本研究的主要内容 | 第19-20页 |
| 1.6.2 本研究的意义 | 第20-21页 |
| 第二章 米曲霉乳糖酶基因的合成及其在乳酸克鲁维酵母GG799中的高效表达 | 第21-41页 |
| 2.1 实验材料 | 第21-24页 |
| 2.1.1 菌株与表达载体 | 第21-22页 |
| 2.1.2 主要工具酶与试剂 | 第22页 |
| 2.1.3 主要仪器与设备 | 第22页 |
| 2.1.4 主要培养基及配方 | 第22-23页 |
| 2.1.5 主要缓冲液及其组成 | 第23页 |
| 2.1.6 蛋白质电泳试剂 | 第23-24页 |
| 2.1.7 薄层层析试剂 | 第24页 |
| 2.2 实验方法 | 第24-31页 |
| 2.2.1 米曲霉乳糖酶基因的合成及优化 | 第24页 |
| 2.2.2 重组质粒pKLAC1-lacA的构建 | 第24页 |
| 2.2.3 线性化重组质粒的制备 | 第24-25页 |
| 2.2.4 K.lactis GG799 感受态细胞的制备 | 第25-26页 |
| 2.2.5 重组菌株的构建 | 第26页 |
| 2.2.6 重组菌株初筛、复筛及验证 | 第26-29页 |
| 2.2.7 乳糖酶活性的测定 | 第29-31页 |
| 2.3 结果与分析 | 第31-39页 |
| 2.3.1 米曲霉乳糖酶基因的合成 | 第31-33页 |
| 2.3.2 表达载体pKLAC1-lacA的构建及SacⅡ酶切鉴定 | 第33-34页 |
| 2.3.3 制备乳酸克鲁维酵母感受态细胞 | 第34-35页 |
| 2.3.4 重组菌株的构建 | 第35页 |
| 2.3.5 重组菌株的初筛 | 第35-36页 |
| 2.3.6 重组菌株的复筛 | 第36-37页 |
| 2.3.7 重组菌株生物量及产酶活性测定 | 第37页 |
| 2.3.8 重组菌株的PCR鉴定 | 第37-38页 |
| 2.3.9 重组菌株表达产物的SDS-PAGE电泳分析 | 第38-39页 |
| 2.3.10 乳糖水解产物的TCL分析 | 第39页 |
| 2.4 本章小结 | 第39-41页 |
| 第三章 乳酸克鲁维酵母工程菌株产乳糖酶发酵条件的优化 | 第41-54页 |
| 3.1 实验材料 | 第41-42页 |
| 3.1.1 菌株 | 第41页 |
| 3.1.2 试剂 | 第41页 |
| 3.1.3 培养基 | 第41-42页 |
| 3.1.4 仪器 | 第42页 |
| 3.2 实验方法 | 第42-44页 |
| 3.2.1 乳糖酶活力的测定 | 第42页 |
| 3.2.2 菌株的活化与初筛 | 第42页 |
| 3.2.3 碳源对乳糖酶发酵的影响试验 | 第42页 |
| 3.2.4 碳源浓度对乳糖酶发酵的影响试验 | 第42-43页 |
| 3.2.5 氮源对乳糖酶发酵的影响试验 | 第43页 |
| 3.2.6 氮源浓度对乳糖酶发酵的影响试验 | 第43页 |
| 3.2.7 生长因子及无机盐离子对乳糖酶发酵的影响试验 | 第43-44页 |
| 3.2.8 正交试验设计 | 第44页 |
| 3.2.9 pH对乳糖酶发酵的影响试验 | 第44页 |
| 3.2.10 温度对乳糖酶发酵的影响试验 | 第44页 |
| 3.3 结果与讨论 | 第44-53页 |
| 3.3.1 碳源对乳糖酶发酵的影响 | 第44-45页 |
| 3.3.2 碳源浓度对乳糖酶发酵的影响 | 第45-46页 |
| 3.3.3 氮源对乳糖酶发酵的影响 | 第46-47页 |
| 3.3.4 氮源浓度对乳糖酶发酵的影响 | 第47页 |
| 3.3.5 生长因子及无机盐离子对乳糖酶发酵的影响 | 第47-49页 |
| 3.3.6 正交试验结果 | 第49-51页 |
| 3.3.7 pH对乳糖酶发酵的影响实验 | 第51-52页 |
| 3.3.8 温度对乳糖酶发酵的影响实验 | 第52-53页 |
| 3.4 本章小结 | 第53-54页 |
| 第四章 重组乳糖酶基本酶学性质的研究 | 第54-59页 |
| 4.1 实验材料 | 第54-55页 |
| 4.1.1 菌株 | 第54页 |
| 4.1.2 试剂 | 第54页 |
| 4.1.3 培养基 | 第54页 |
| 4.1.4 仪器 | 第54页 |
| 4.1.5 缓冲液 | 第54-55页 |
| 4.2 实验方法 | 第55页 |
| 4.2.1 乳糖酶活力的测定 | 第55页 |
| 4.2.2 重组乳糖酶最适反应温度的测定 | 第55页 |
| 4.2.3 重组乳糖酶最适反应pH的测定 | 第55页 |
| 4.2.4 重组乳糖酶的低温保存稳定性 | 第55页 |
| 4.3 结论与讨论 | 第55-57页 |
| 4.3.1 重组乳糖酶最适反应温度的测定 | 第55-56页 |
| 4.3.2 重组乳糖酶最适反应pH的测定 | 第56-57页 |
| 4.3.3 重组乳糖酶的低温保存稳定性 | 第57页 |
| 4.4 本章小结 | 第57-59页 |
| 总结与展望 | 第59-61页 |
| 总结 | 第59-60页 |
| 展望 | 第60-61页 |
| 参考文献 | 第61-67页 |
| 攻读硕士学位期间取得的研究成果 | 第67-69页 |
| 致谢 | 第69页 |
