| 摘要 | 第6-8页 |
| ABSTRACT | 第8-10页 |
| 缩略语索引 | 第17-19页 |
| 第一章 绪论 | 第19-32页 |
| 1.1 失眠及其危害 | 第19-20页 |
| 1.2 中药治疗失眠症 | 第20-22页 |
| 1.2.1 治疗失眠的方法 | 第20页 |
| 1.2.2 中药治疗 | 第20-22页 |
| 1.2.2.1 天麻提取物 | 第20-21页 |
| 1.2.2.2 酸枣仁提取物 | 第21-22页 |
| 1.3 G蛋白偶联受体 | 第22-23页 |
| 1.4 食欲素 | 第23-27页 |
| 1.4.1 食欲素神经元和食欲素 | 第23-24页 |
| 1.4.2 食欲素受体 | 第24-25页 |
| 1.4.3 食欲素介导的信号通路 | 第25-26页 |
| 1.4.4 食欲素参与的睡眠-觉醒周期的调节作用 | 第26-27页 |
| 1.5 荧光共振能量转移(FRET)技术 | 第27-29页 |
| 1.6 本论文研究意义 | 第29-31页 |
| 1.7 本实验研究技术路线 | 第31-32页 |
| 1.7.1 构建载体 | 第31页 |
| 1.7.2 建立诱导表达质粒分子探针的稳定细胞系 | 第31页 |
| 1.7.3 稳定细胞系的鉴定 | 第31-32页 |
| 1.7.4 初步筛选粗提的中药成分 | 第32页 |
| 第二章 构建食欲素受体分子探针质粒 | 第32-62页 |
| 2.1 实验材料 | 第32-35页 |
| 2.1.1 载体、菌种及质粒 | 第32-33页 |
| 2.1.2 实验仪器和设备 | 第33-34页 |
| 2.1.3 实验试剂 | 第34-35页 |
| 2.1.4 实验试剂配方 | 第35页 |
| 2.2 实验内容 | 第35-52页 |
| 2.2.1 构建食欲素受体分子探针质粒 | 第35-52页 |
| 2.2.1.1 Clontech kit (In-FusionHD Cloning Kit) | 第36-38页 |
| 2.2.1.2 In-Fusion HD Cloning Kit引物设计原理 | 第38-40页 |
| 2.2.1.3 引物设计 | 第40-42页 |
| 2.2.1.4 普通PCR扩增目的片段 | 第42-45页 |
| 2.2.1.5 琼脂糖凝胶电泳 | 第45-46页 |
| 2.2.1.6 胶回收(promega) | 第46-47页 |
| 2.2.1.7 clontech kit连接反应 | 第47页 |
| 2.2.1.8 制备E.coli DH 5α感受态细胞 | 第47-48页 |
| 2.2.1.9 转化(E.coli DH 5α感受态细胞) | 第48-49页 |
| 2.2.1.10 菌落PCR | 第49-50页 |
| 2.2.1.11 抽提质粒 | 第50-51页 |
| 2.2.1.12 比对序列 | 第51页 |
| 2.2.1.13 质粒大提(QIAGEN kit) | 第51-52页 |
| 2.3 实验结果 | 第52-60页 |
| 2.3.1 构建含OX1R和OX2R质粒分子探针 | 第52-57页 |
| 2.3.1.1 纯化PCR扩增目的基因片段产物 | 第52-53页 |
| 2.3.1.2 菌落PCR验证 | 第53-55页 |
| 2.3.1.3 抽提质粒 | 第55-56页 |
| 2.3.1.4 插入片段的序列验证 | 第56-57页 |
| 2.3.2 构建食欲素受体质粒分子探针 | 第57-60页 |
| 2.3.2.1 纯化PCR扩增目的基因片段产物 | 第57页 |
| 2.3.2.2 菌落PCR验证 | 第57-58页 |
| 2.3.2.3 抽提质粒 | 第58-59页 |
| 2.3.2.4 插入片段的序列验证 | 第59-60页 |
| 2.3.2.5 pOG44抽提质粒 | 第60页 |
| 2.4 小结 | 第60-61页 |
| 2.5 讨论 | 第61-62页 |
| 第三章 食欲素受体分子探针稳定细胞系的构建及验证 | 第62-82页 |
| 3.1 实验材料 | 第62-66页 |
| 3.1.1 实验用细胞 | 第62页 |
| 3.1.2 实验试剂 | 第62-63页 |
| 3.1.3 实验仪器及实验设备 | 第63-64页 |
| 3.1.4 试剂配方 | 第64-66页 |
| 3.2 实验方法 | 第66-75页 |
| 3.2.1 细胞培养 | 第66页 |
| 3.2.2 细胞复苏 | 第66-67页 |
| 3.2.3 细胞传代 | 第67页 |
| 3.2.4 细胞冻存 | 第67-68页 |
| 3.2.5 细胞计数 | 第68页 |
| 3.2.6 细胞转染 | 第68-75页 |
| 3.2.6.1 食欲素受体分子探针质粒瞬时高表达实验 | 第69-70页 |
| 3.2.6.2 Western blotting检测分子探针的有效性 | 第70-73页 |
| 3.2.6.3 Hygromycin B筛选浓度的确定 | 第73页 |
| 3.2.6.4 建立诱导表达食欲素受体分子探针的稳定细胞系 | 第73-74页 |
| 3.2.6.5 Doxycycline诱导细胞表达受体的最佳浓度的确定 | 第74-75页 |
| 3.2.6.6 食欲素受体分子探针稳定细胞系的P-ERK活性测定实验 | 第75页 |
| 3.3 实验结果 | 第75-80页 |
| 3.3.1 质粒瞬时转染HEK 293T细胞 | 第75-76页 |
| 3.3.2 瞬时转染后,Western blot检测结果 | 第76-77页 |
| 3.3.3 质粒稳定转染Flp-InT-Rex HEK293细胞 | 第77-79页 |
| 3.3.3.1 Hygromycin B筛选浓度的确定 | 第77-78页 |
| 3.3.3.2 Doxycycline诱导细胞表达受体的最佳浓度的确定 | 第78-79页 |
| 3.3.3.3 稳定细胞系的荧光检测 | 第79页 |
| 3.3.4 稳定转染后,Western blot检测结果 | 第79-80页 |
| 3.4 小结 | 第80-81页 |
| 3.5 讨论 | 第81-82页 |
| 第四章 荧光共振能量转移技术检测天麻、酸枣仁醇提物中镇静安神成分 | 第82-91页 |
| 4.1 实验材料 | 第82页 |
| 4.1.1 实验用细胞 | 第82页 |
| 4.1.2 实验仪器和设备 | 第82页 |
| 4.1.3 实验试剂 | 第82页 |
| 4.2 实验方法 | 第82-84页 |
| 4.2.1 细胞培养 | 第82-83页 |
| 4.2.2 细胞复苏 | 第83页 |
| 4.2.3 细胞传代 | 第83页 |
| 4.2.4 细胞冻存 | 第83页 |
| 4.2.5 细胞计数 | 第83页 |
| 4.2.6 FRET实验 | 第83-84页 |
| 4.2.6.1 中药提取 | 第83-84页 |
| 4.2.6.2 FRET实验 | 第84页 |
| 4.3 实验结果 | 第84-89页 |
| 4.3.1 市售的激动剂食欲素A处理细胞后,FRET曲线 | 第84-86页 |
| 4.3.2 中药(天麻、酸枣仁)提取物处理细胞后,FRET曲线 | 第86-89页 |
| 4.3.2.1 中药直接处理细胞后,FRET曲线 | 第86-88页 |
| 4.3.2.2 拮抗剂孵育后,中药处理细胞检测的FRET曲线 | 第88-89页 |
| 4.4 小结与讨论 | 第89-91页 |
| 第五章 总结 | 第91-93页 |
| 5.1 成功构建食欲素受体分子探针质粒 | 第91页 |
| 5.2 成功建立是食欲素受体分子探针质粒的稳定细胞系 | 第91-92页 |
| 5.3 依据荧光共振能量转移技术初步筛选中药粗提物 | 第92-93页 |
| 致谢 | 第93-94页 |
| 参考文献 | 第94-103页 |
| 附录A 攻读硕士期间发表论文目录 | 第103-105页 |
| 附录B OX1R编码基因序列 | 第105-107页 |
| 附录C OX2R编码基因序列 | 第107-109页 |
| 附录D 其他需要说明的内容 | 第109页 |
