| 致谢 | 第4-10页 |
| 英文缩写词表 | 第10-11页 |
| 摘要 | 第11-14页 |
| 文献综述 | 第14-26页 |
| 第一章 猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)简介 | 第14-21页 |
| 1.1 PRRS的发现历史 | 第14页 |
| 1.1.1 PRRS在国外的出现与确认 | 第14页 |
| 1.1.2 PRRS传入中国 | 第14页 |
| 1.2 PRRS的流行及其危害 | 第14-19页 |
| 1.2.1 全球PRRS流行的时空顺序和范围 | 第14-15页 |
| 1.2.2 我国PRRS流行的三次高峰期及其原因 | 第15-16页 |
| 1.2.3 PRRS临床致病性差异 | 第16-17页 |
| 1.2.4 对不同类型猪群的影响 | 第17页 |
| 1.2.5 免疫抑制 | 第17-19页 |
| 1.3 PRRS的防控现状 | 第19-21页 |
| 1.3.1 欧美主要发达国家PRRS的防控 | 第19-20页 |
| 1.3.2 中国PRRS的防控 | 第20-21页 |
| 第二章 PRRS病毒(PRRSV)病原学研究进展 | 第21-26页 |
| 2.1 病毒分类地位 | 第21页 |
| 2.1.1 早期分类 | 第21页 |
| 2.1.2 最新分类 | 第21页 |
| 2.2 病毒基本特征 | 第21-23页 |
| 2.2.1 形态特征 | 第21-22页 |
| 2.2.2 基因组特征及化学组成 | 第22页 |
| 2.2.3 培养特性 | 第22-23页 |
| 2.3 毒株变异 | 第23-24页 |
| 2.3.1 毒株序列及致病性变异 | 第23页 |
| 2.3.2 病毒重组 | 第23-24页 |
| 2.4 病原学研究领域仍待解决的问题 | 第24-26页 |
| 试验研究 | 第26-75页 |
| 第三章 PRRSV1、PRRSV2毒株单一和双重RT-PCR检测方法的建立 | 第26-39页 |
| 引言 | 第26页 |
| 3.1 材料与方法 | 第26-30页 |
| 3.1.1 菌株、载体及主要试剂 | 第26-27页 |
| 3.1.2 病毒株、阳性cDNA和临床病料 | 第27页 |
| 3.1.3 引物设计与合成 | 第27页 |
| 3.1.4 临床样品处理 | 第27页 |
| 3.1.5 病毒核酸提取 | 第27-28页 |
| 3.1.5.1 病毒RNA提取及反转录 | 第27-28页 |
| 3.1.5.2 病毒DNA提取 | 第28页 |
| 3.1.6 PRRSV2Nsp2基因鉴别RT-PCR反应参数的优化 | 第28-30页 |
| 3.1.6.1 PRRSV2Nsp2基因鉴别RT-PCR退火温度优化 | 第28-29页 |
| 3.1.6.2 PRRSV2Nsp2基因鉴别RT-PCR引物浓度优化 | 第29页 |
| 3.1.6.3 PRRSV2Nsp2基因鉴别RT-PCR循环数优化 | 第29页 |
| 3.1.6.4 PRRSV2Nsp2基因鉴别RT-PCR特异性实验 | 第29页 |
| 3.1.6.5 PRRSV2Nsp2鉴别RT-PCR基因敏感性实验 | 第29页 |
| 3.1.6.6 PRRSV2Nsp2基因鉴别RT-PCR重复性实验 | 第29页 |
| 3.1.6.7 PRRSV2Nsp2基因鉴别RT-PCR方法的临床应用 | 第29-30页 |
| 3.1.7 PRRSV1和PRRSV2ORF5基因双重RT-PCR反应参数的优化 | 第30页 |
| 3.1.7.1 RRSV1和PRRSV2ORF5基因单一RT-PCR退火温度优化 | 第30页 |
| 3.1.7.2 RRSV1和PRRSV2双重RT-PCR扩增 | 第30页 |
| 3.1.7.3 RRSV1和PRRSV2双重PCR特异性分析 | 第30页 |
| 3.1.7.4 RRSV1和PRRSV2双重RT-PCR敏感性试验 | 第30页 |
| 3.1.7.5 RRSV1和PRRSV2双重RT-PCR稳定性试验 | 第30页 |
| 3.1.7.6 PRRSV1和PRRSV2单一和双重RT-PCR的检测结果吻合性比较 | 第30页 |
| 3.2 结果 | 第30-37页 |
| 3.2.1 PRRSV2Nsp2鉴别RT-PCR最佳反应参数 | 第30-34页 |
| 3.2.1.1 PRRSV2Nsp2鉴别RT-PCR最佳退火温度 | 第30-31页 |
| 3.2.1.2 PRRSV2Nsp2鉴别RT-PCR最佳引物浓度和循环数 | 第31-32页 |
| 3.2.1.3 PRRSV2Nsp2鉴别RT-PCR特异性检测 | 第32-33页 |
| 3.2.1.4 Nsp2鉴别RT-PCRcDNA最小检出量分别为2.20×10-1ng~3.10×10-1ng | 第33页 |
| 3.2.1.5 PRRSV2Nsp2鉴别RT-PCR重复性较好 | 第33-34页 |
| 3.2.1.6 PRRSV2Nsp2鉴别RT-PCR临床样品检测 | 第34页 |
| 3.2.2 RRSV1和PRRSV2ORF5基因单一RT-PCR扩增出预期目的片段 | 第34-35页 |
| 3.2.3 RRSV1和PRRSV2双重RT-PCR最佳反反应参数 | 第35页 |
| 3.2.4 RRSV1和PRRSV2双重RT-PCR具有良好特异性 | 第35-36页 |
| 3.2.5 双重RT-PCR最小检出量分别为3.39×10-2ng和3.67×10-2ng | 第36页 |
| 3.2.6 RRSV1和PRRSV2双重RT-PCR具有良好稳定性 | 第36-37页 |
| 3.2.7 双重RT-PCR的检测结果良好 | 第37页 |
| 3.3 分析与讨论 | 第37-39页 |
| 第四章 PRRSV2不同类型毒株的分离鉴定及重组、变异分析 | 第39-50页 |
| 引言 | 第39页 |
| 4.1 材料与方法 | 第39-42页 |
| 4.1.1 病料采集与处理 | 第39页 |
| 4.1.2 细胞、菌株、载体、毒株及抗体 | 第39-40页 |
| 4.1.3 主要试剂 | 第40页 |
| 4.1.4 试验动物 | 第40页 |
| 4.1.5 引物设计与合成 | 第40页 |
| 4.1.5.1 ORF5基因扩增引物 | 第40页 |
| 4.1.5.2 Nsp2基因鉴别引物 | 第40页 |
| 4.1.5.3 全基因序列扩增引物 | 第40页 |
| 4.1.5.4 其他引物 | 第40页 |
| 4.1.6 病毒分离 | 第40页 |
| 4.1.7 分离物的RT-PCR鉴定 | 第40-41页 |
| 4.1.8 分离物外源病毒的检测 | 第41页 |
| 4.1.9 间接免疫荧光(IFA)鉴定 | 第41页 |
| 4.1.10 分离毒株生长曲线测定 | 第41页 |
| 4.1.11 目的基因克隆与测序 | 第41-42页 |
| 4.1.12 全基因组序列分析 | 第42页 |
| 4.1.13 全基因组重组特征分析 | 第42页 |
| 4.1.14 分离物对断奶仔猪的致病性 | 第42页 |
| 4.2 结果 | 第42-48页 |
| 4.2.1 成功获得20株流行毒株 | 第42页 |
| 4.2.2 RT-PCR检测结果呈PRRSV阳性 | 第42页 |
| 4.2.3 间接免疫荧光试验(IFA)检测PRRSV呈阳性 | 第42-44页 |
| 4.2.4 三株分离毒株增殖特征存在差异 | 第44页 |
| 4.2.5 分离毒株核苷酸相似性存在差异 | 第44-45页 |
| 4.2.5.1 Nsp2基因核苷酸相似性分析 | 第44页 |
| 4.2.5.2 ORF5基因核苷酸相似性分析 | 第44-45页 |
| 4.2.5.3 三株流行毒株全基因序列与NADC30株遗传进化距离较近 | 第45页 |
| 4.2.5.4 三株PRRSV2分离毒均存在重组,且重组模式不一致 | 第45页 |
| 4.2.6 两个分离物的致病性有明显差异 | 第45-48页 |
| 4.2.6.1 不同毒株攻毒后猪只体温变化及平均日增重差异 | 第45-47页 |
| 4.2.6.2 肺脏剖检及组织学病理变化明显 | 第47-48页 |
| 4.2.6.3 人工感染猪病毒血症及脏器病毒载量与采样时间有关 | 第48页 |
| 4.3 分析与讨论 | 第48-50页 |
| 第五章 PRRSV1毒株的分离鉴定、全序列分析及分子流行病学调查 | 第50-60页 |
| 引言 | 第50页 |
| 5.1 材料与方法 | 第50-52页 |
| 5.1.1 病料采集与处理 | 第50页 |
| 5.1.2 细胞、菌株、载体、PRRSV1阳性cDNA | 第50页 |
| 5.1.3 主要试剂 | 第50页 |
| 5.1.4 引物设计与合成 | 第50-51页 |
| 5.1.5 RT-PCR检测 | 第51页 |
| 5.1.6 病毒分离 | 第51-52页 |
| 5.1.7 基因克隆与测序 | 第52页 |
| 5.1.8 分离毒株基因组序列分析 | 第52页 |
| 5.2 结果 | 第52-56页 |
| 5.2.1 临床样品RT-PCR扩增出预期片段 | 第52页 |
| 5.2.2 成功分离出一株PRRSV1流行毒株 | 第52-54页 |
| 5.2.3 分离毒株基因序列与PRRSV1相似性性较高 | 第54-56页 |
| 5.2.3.1 6株分离株ORF5基因序列比对结果均为PRRSV1 | 第54页 |
| 5.2.3.2 分离毒株HENZMD-10全基因序列比对与PRRSV1毒株相似性较高 | 第54页 |
| 5.2.3.3 PRRSV1分离株HENZMD-10非结构基因、结构基因存在变异 | 第54-56页 |
| 5.2.3.4 PRRSV1分离株HENZMD-10全基因遗传进化分析 | 第56页 |
| 5.3 分析与讨论 | 第56-60页 |
| 第六章 不同毒株PRRSV的体外交叉中和试验 | 第60-66页 |
| 引言 | 第60页 |
| 6.1 材料与方法 | 第60-63页 |
| 6.1.1 主要试剂材料及实验动物 | 第60页 |
| 6.1.2 毒株、细胞 | 第60-61页 |
| 6.1.3 病毒增殖、纯化 | 第61页 |
| 6.1.4 增殖病毒毒价测定 | 第61页 |
| 6.1.5 病毒纯化及免疫用抗原制备 | 第61页 |
| 6.1.6 免疫接种及制备兔抗PRRSV高免血清 | 第61页 |
| 6.1.7 兔抗PRRSV高免血清中和效价测定 | 第61-62页 |
| 6.1.8 不同毒株体外交叉中和试验测定 | 第62-63页 |
| 6.2 结果 | 第63-65页 |
| 6.2.1 接毒细胞出现明显细胞病变 | 第63页 |
| 6.2.2 TCID50结果 | 第63页 |
| 6.2.3 兔抗高免血清中和效价分别为1:50、1:17、1:58 | 第63-64页 |
| 6.2.4 交叉中和试验显示JXA1-R高免血清对不同毒株的保护力最高 | 第64-65页 |
| 6.3 分析与讨论 | 第65-66页 |
| 第七章 PRRSV和GETV双重RT-PCR检测方法的建立与应用 | 第66-75页 |
| 引言 | 第66-67页 |
| 7.1 材料与方法 | 第67-69页 |
| 7.1.1 病毒株及临床病料 | 第67页 |
| 7.1.2 试剂、载体 | 第67页 |
| 7.1.3 引物设计与合成 | 第67页 |
| 7.1.4 病料处理 | 第67-68页 |
| 7.1.5 病毒核酸提取 | 第68页 |
| 7.1.5.1 病毒RNA提取及反转录 | 第68页 |
| 7.1.5.2 病毒DNA提取 | 第68页 |
| 7.1.6 单一PCR扩增及基因序列验证 | 第68页 |
| 7.1.7 双重PCR扩增 | 第68-69页 |
| 7.1.8 双重RT-PCR特异性实验 | 第69页 |
| 7.1.9 双重RT-PCR敏感性实验 | 第69页 |
| 7.1.10 双重RT-PCR重复性试验 | 第69页 |
| 7.1.11 双重RT-PCR方法的临床应用及与单一RT-PCR方法的吻合性比较 | 第69页 |
| 7.2 结果 | 第69-73页 |
| 7.2.1 PRRSV和GETV单一RT-PCR成功扩增出预期片段 | 第69-70页 |
| 7.2.2 双重RT-PCR最佳反应体系及条件 | 第70-71页 |
| 7.2.3 双重RT-PCR具有特异性 | 第71页 |
| 7.2.4 双重RT-PCR最小检出量分别为2.48×10-4～2.50×10-5ng | 第71-72页 |
| 7.2.5 双重RT-PCR具有良好可重复性 | 第72页 |
| 7.2.6 临床样品的检测应用 | 第72-73页 |
| 7.3 分析与讨论 | 第73-75页 |
| 全文总结 | 第75-76页 |
| 参考文献 | 第76-93页 |
| ABSTRACT | 第93-97页 |
| 附：作者读研期间发表的论文及其他成果 | 第98-99页 |
