| 英文缩略词表 | 第7-9页 |
| 摘要 | 第9-11页 |
| Abstract | 第11-13页 |
| 一. 前言 | 第14-21页 |
| 1. 流感病毒聚合酶复合体中的宿主适应性突变 | 第14-15页 |
| 2. 流感病毒复制相关的宿主因子研究 | 第15-17页 |
| 2.1 IFITM3基因研究现状 | 第15-16页 |
| 2.2 Importin-α7基因研究现状 | 第16-17页 |
| 3. 文库筛选流感病毒复制相关的宿主因子 | 第17-19页 |
| 4. 本研究的主要研究内容 | 第19-21页 |
| 二. 材料与方法 | 第21-47页 |
| 1. IFITM3或importin-α7基因敲除细胞系的构建 | 第21-24页 |
| 1.1 sgRNAs的设计 | 第21页 |
| 1.2 sgRNAs重组质粒的构建 | 第21-23页 |
| 1.3 sgRNAs重组质粒转染靶细胞并筛选单克隆细胞系 | 第23页 |
| 1.4 单克隆细胞系的western blotting验证 | 第23页 |
| 1.5 单克隆细胞系的测序验证 | 第23-24页 |
| 2. 流感病毒制备 | 第24-29页 |
| 2.1 野生型流感病毒 | 第24-25页 |
| 2.2 重组流感病毒 | 第25-28页 |
| 2.3 病毒浓缩 | 第28页 |
| 2.4 病毒纯化 | 第28-29页 |
| 3. 病毒滴定 | 第29-30页 |
| 3.1 TCID_(50)测定 | 第29-30页 |
| 3.2 生长曲线或动物组织样本的病毒定量 | 第30页 |
| 4. 携带海肾荧光素酶的重组流感病毒复制水平的检测 | 第30-31页 |
| 5. 流感病毒聚合酶活性测定 | 第31-32页 |
| 6. 生长曲线测定 | 第32页 |
| 7. 激光共聚焦实验 | 第32-33页 |
| 8. 小鼠实验 | 第33-36页 |
| 8.1 小鼠感染实验 | 第33页 |
| 8.2 血凝试验和血凝抑制试验 | 第33-35页 |
| 8.3 病理实验 | 第35-36页 |
| 9. 人CRISPR/Cas9敲除文库筛选EAH1N1 SIVs复制相关的宿主因子 | 第36-47页 |
| 9.1 文库质粒的扩增 | 第37-39页 |
| 9.2 文库慢病毒的制备 | 第39-41页 |
| 9.3 A549-Cas9稳定细胞系的制备 | 第41-42页 |
| 9.4 文库细胞的制备 | 第42-43页 |
| 9.5 EA H1N1 SIVs感染文库细胞筛选流感病毒复制相关的宿主因子 | 第43-45页 |
| 9.6 NGS检测文库覆盖度及结果分析 | 第45-47页 |
| 三. 结果 | 第47-73页 |
| 第一部分 基于CRISPR/Cas9系统构建IFITM3/importin-α7基因敲除细胞系 | 第47-54页 |
| 1.构建IFITM3基因敲除的Hela细胞系 | 第47-50页 |
| 1.1 IFITM3-sgRNAs重组质粒的构建 | 第47页 |
| 1.2 IFITM3基因敲除单克隆细胞系的western blotting验证 | 第47-48页 |
| 1.3 IFITM3基因敲除单克隆细胞系的测序验证 | 第48页 |
| 1.4 IFITM3基因敲除后流感病毒复制滴度增加 | 第48-49页 |
| 1.5 Hela-IFITM3-KO中外源IFITM3的表达使流感病毒复制回复至野生型水平 | 第49-50页 |
| 2. 构建importin-α7基因敲除的A549细胞系 | 第50-54页 |
| 2.1 Importin-α7-sgRNAs重组质粒的构建 | 第50页 |
| 2.2 Importin-α7基因敲除单克隆细胞系的测序验证 | 第50-51页 |
| 2.3 Importin-α7基因敲除单克隆细胞系的western blotting验证 | 第51页 |
| 2.4 脱靶验证 | 第51-53页 |
| 2.5 Importin-α7基因敲除后流感病毒复制滴度降低 | 第53页 |
| 2.6 Importin-α7是流感病毒vRNPs入核必需的 | 第53-54页 |
| 第二部分 Importin-α7对EA H1N1 SIVs中PB2 D701N突变致病机制的影响 | 第54-64页 |
| 1. Importin-α7对不同来源、不同型别流感病毒复制的影响 | 第54-55页 |
| 2. EA H1N1 SIVs中PB2 D701N突变诱导的病毒复制增强依赖importin-α7 | 第55-57页 |
| 3. EA H1N1 SIVs中PB2 D701N突变诱导的vRNPs入核增加依赖importin-α7 | 第57-58页 |
| 4. EA H1N1 SIVs中PB2 D701N突变增强哺乳动物细胞中病毒聚合酶活性及病毒复制水平 | 第58页 |
| 5. EA H1N1 SIVs中PB2 D701N突变增强病毒对小鼠的致病力 | 第58-64页 |
| 5.1 PB2 D701N突变增强了病毒对小鼠的致病性 | 第58-60页 |
| 5.2 PB2 D701N突变增强了病毒对小鼠的致死性 | 第60-62页 |
| 5.3 PB2 D701N突变增加小鼠呼吸道组织中的病毒复制滴度 | 第62-63页 |
| 5.4 PB2 D701N突变增强病毒感染后小鼠肺脏病理变化 | 第63-64页 |
| 第三部分 CRISPR/Cas9文库筛选EA H1N1 SIVs复制相关的宿主因子 | 第64-73页 |
| 1. 文库质粒的扩增 | 第64页 |
| 2. 文库慢病毒的制备 | 第64页 |
| 3. A549-Cas9稳定细胞系的制备 | 第64-68页 |
| 3.1 慢病毒感染A549细胞的最优MOI | 第64-66页 |
| 3.2 A549-Cas9稳定细胞系的构建 | 第66-68页 |
| 4. 文库细胞的制备 | 第68-69页 |
| 4.1 细胞流式术确定文库慢病毒感染A549-Cas9靶细胞的剂量 | 第68-69页 |
| 4.2 文库慢病毒感染A549-Cas9靶细胞构建文库细胞 | 第69页 |
| 5. EA H1N1 SIVs感染文库细胞筛选流感病毒复制相关的宿主因子 | 第69-73页 |
| 四. 讨论 | 第73-76页 |
| 五. 结论 | 第76-77页 |
| 六. 参考文献 | 第77-83页 |
| 七. 综述 | 第83-104页 |
| 参考文献 | 第94-104页 |
| 八. 致谢 | 第104-106页 |
| 九. 博士生期间科研成果 | 第106页 |
