| 摘要 | 第13-15页 |
| Abstract | 第15-17页 |
| 缩略表 | 第18-19页 |
| 第一章 文献综述 | 第19-39页 |
| 1 盐害对植物的影响 | 第19-20页 |
| 1.1 渗透胁迫 | 第19-20页 |
| 1.2 离子胁迫 | 第20页 |
| 1.3 营养胁迫 | 第20页 |
| 2 植物耐盐的生理基础 | 第20-21页 |
| 2.1 细胞中高的K~+/Na~+比 | 第20-21页 |
| 2.2 渗透调节 | 第21页 |
| 3 调控细胞内离子平衡的阳离子转运系统 | 第21-37页 |
| 3.1 Ca~(2+)和钙信号 | 第22-26页 |
| 3.1.1 钙调素 | 第23页 |
| 3.1.2 类似钙调磷酸酶B亚基蛋白 | 第23-25页 |
| 3.1.3 钙依赖性蛋白激酶CDPK | 第25-26页 |
| 3.2 NHX途径 | 第26-28页 |
| 3.3 SOS途径 | 第28-31页 |
| 3.4 CBL-CIPK信号途径 | 第31-34页 |
| 3.5 植物体内的磷酸化和去磷酸化途径 | 第34-37页 |
| 4 盐生植物海马齿耐盐进展 | 第37页 |
| 5 本研究的目的意义 | 第37-38页 |
| 6 本研究的技术路线 | 第38-39页 |
| 第二章 海马齿质膜Na~+/H~+逆转运蛋白基因SpSOS1的克隆及功能分析 | 第39-77页 |
| 1 研究背景 | 第39-40页 |
| 2 材料与方法 | 第40-53页 |
| 2.1 实验材料 | 第40-41页 |
| 2.1.1 植物材料 | 第40页 |
| 2.1.2 菌株及载体 | 第40-41页 |
| 2.1.3 酶、生化试剂及试剂盒 | 第41页 |
| 2.2 实验方法 | 第41-53页 |
| 2.2.1 RNA提取 | 第41-42页 |
| 2.2.2 反转录反应 | 第42页 |
| 2.2.3 SpSOS1中间片段克隆 | 第42-44页 |
| 2.2.3.1 引物设计 | 第42-43页 |
| 2.2.3.2 PCR反应体系及条件 | 第43页 |
| 2.2.3.3 PCR产物回收 | 第43页 |
| 2.2.3.4 PCR产物连接T载体 | 第43页 |
| 2.2.3.5 大肠杆菌感受态的制备 | 第43-44页 |
| 2.2.3.6 连接产物转化 | 第44页 |
| 2.2.3.7 阳性克隆检测 | 第44页 |
| 2.2.4 SpSOS1两翼序列的扩增 | 第44-45页 |
| 2.2.4.1 SpSOS13’-末端引物设计 | 第44页 |
| 2.2.4.2 SpSOS13’-末端扩增 | 第44页 |
| 2.2.4.3 SpSOS15’-末端引物设计 | 第44-45页 |
| 2.2.4.4 SpSOS15’-末端扩增 | 第45页 |
| 2.2.4.5 SpSOS13’-RACE和 5’-RACE扩增条件 | 第45页 |
| 2.2.5 SpSOS1全长基因克隆 | 第45-46页 |
| 2.2.5.1 RNA提取 | 第45页 |
| 2.2.5.2 反转录 | 第45页 |
| 2.2.5.3 SpSOS1全长基因引物设计 | 第45页 |
| 2.2.5.4 SpSOS1全长扩增 | 第45-46页 |
| 2.2.5.5 SpSOS1 PCR产物测序 | 第46页 |
| 2.2.6 SpSOS1基因表达模式分析 | 第46-47页 |
| 2.2.6.1 实时荧光定量PCR引物设计 | 第46页 |
| 2.2.6.2 实时荧光定量PCR反应体系及条件 | 第46-47页 |
| 2.2.6.3 相对表达量的计算 | 第47页 |
| 2.2.7 SpSOS1蛋白的亚细胞定位 | 第47-49页 |
| 2.2.7.1 定位载体的构建 | 第47-48页 |
| 2.2.7.2 重组质粒DNA提取 | 第48页 |
| 2.2.7.3 重组质粒检测 | 第48页 |
| 2.2.7.4 农杆菌感受态细胞制备 | 第48页 |
| 2.2.7.5 重组质粒转化农杆菌 | 第48-49页 |
| 2.2.7.6 农杆菌介导的烟草瞬时表达 | 第49页 |
| 2.2.7.7 烟草原生质体制备 | 第49页 |
| 2.2.7.8 激光共聚焦显微镜检测 | 第49页 |
| 2.2.8 SpSOS1蛋白在酵母中的功能验证 | 第49-51页 |
| 2.2.8.1 酵母表达载体的构建 | 第49-50页 |
| 2.2.8.2 醋酸锂法转化酵母 | 第50页 |
| 2.2.8.3 酵母菌落PCR | 第50页 |
| 2.2.8.4 酵母功能互补试验 | 第50-51页 |
| 2.2.8.5 转基因酵母离子含量测定 | 第51页 |
| 2.2.9 SpSOS1蛋白在拟南芥中的功能验证 | 第51-53页 |
| 2.2.9.1 真空渗入法转化拟南芥 | 第51-52页 |
| 2.2.9.2 拟南芥抗性苗的筛选 | 第52页 |
| 2.2.9.3 转基因拟南芥的鉴定 | 第52页 |
| 2.2.9.4 转基因拟南芥功能分析 | 第52-53页 |
| 3 结果与分析 | 第53-74页 |
| 3.1 海马齿RNA提取 | 第53页 |
| 3.2 海马齿SpSOS1基因的克隆 | 第53-56页 |
| 3.2.1 SpSOS1基因同源片段的克隆 | 第53-54页 |
| 3.2.2 SpSOS1基因 3’-末端片段扩增 | 第54-55页 |
| 3.2.3 SpSOS1基因 5’-末端片段扩增 | 第55页 |
| 3.2.4 SpSOS1基因全长扩增 | 第55-56页 |
| 3.3 海马齿SpSOS1基因的生物信息学分析 | 第56-59页 |
| 3.3.1 SpSOS1蛋白的理化性质分析 | 第56-59页 |
| 3.3.2 SpSOS1蛋白的进化树分析 | 第59页 |
| 3.4 不同胁迫下SpSOS1基因的表达模式分析 | 第59-66页 |
| 3.4.1 RNA及cDNA检测 | 第59-60页 |
| 3.4.2 扩增曲线与熔解曲线 | 第60-61页 |
| 3.4.3 SpSOS1基因在不同胁迫下的表达分析 | 第61-66页 |
| 3.4.3.1 盐胁迫下SpSOS1基因的表达分析 | 第61-63页 |
| 3.4.3.2 不同温度条件下SpSOS1基因的表达分析 | 第63-64页 |
| 3.4.3.3 ABA胁迫下SpSOS1基因的表达分析 | 第64-65页 |
| 3.4.3.4 干旱胁迫下SpSOS1基因的表达分析 | 第65页 |
| 3.4.3.5 氧化胁迫下SpSOS1基因的表达分析 | 第65-66页 |
| 3.5 SpSOS1的亚细胞定位 | 第66-68页 |
| 3.5.1 定位表达载体的构建 | 第66-67页 |
| 3.5.2 烟草叶片中的定位分析 | 第67-68页 |
| 3.6 SpSOS1蛋白在酵母中的功能分析 | 第68-72页 |
| 3.6.1 酵母表达载体的构建 | 第68-69页 |
| 3.6.2 转基因酵母检测 | 第69-70页 |
| 3.6.3 转基因酵母功能验证 | 第70-71页 |
| 3.6.4 转基因酵母离子含量测定 | 第71-72页 |
| 3.7 SpSOS1蛋白在植物中的功能分析 | 第72-74页 |
| 4 讨论 | 第74-76页 |
| 4.1 SpSOS1是质膜上的Na~+/H~+逆转运蛋白 | 第74页 |
| 4.2 根中SpSOS1基因的表达受盐胁迫诱导 | 第74-75页 |
| 4.3 SpSOS1增强转基因酵母和拟南芥耐盐性 | 第75-76页 |
| 5 本章小结 | 第76-77页 |
| 第三章 SpAHA1和SpSOS1协同作用增强转基因酵母耐盐性 | 第77-100页 |
| 1 研究背景 | 第77-78页 |
| 2 材料与方法 | 第78-83页 |
| 2.1 实验材料 | 第78页 |
| 2.2 海马齿SpAHA1基因克隆 | 第78-79页 |
| 2.2.1 海马齿SpAHA1基因中间片段克隆 | 第78页 |
| 2.2.2 海马齿SpAHA1基因两翼序列的扩增 | 第78页 |
| 2.2.3 海马齿SpAHA1全长基因的扩增 | 第78-79页 |
| 2.3 海马齿SpAHA1基因的表达模式分析 | 第79页 |
| 2.4 SpAHA1蛋白的亚细胞定位 | 第79页 |
| 2.5 转基因酵母耐盐性鉴定 | 第79-80页 |
| 2.5.1 酵母表达载体构建 | 第79页 |
| 2.5.2 酵母转化实验 | 第79页 |
| 2.5.3 酵母功能互补实验 | 第79-80页 |
| 2.6 转基因酵母离子含量测定 | 第80页 |
| 2.7 转基因酵母质膜H~+-ATPase活性和Na~+/H~+交换活性测定 | 第80-83页 |
| 2.7.1 酵母质膜提取 | 第80-81页 |
| 2.7.2 膜蛋白含量测定 | 第81页 |
| 2.7.3 质膜纯度检测 | 第81-82页 |
| 2.7.4 H~+-ATPase活性和Na~+/H~+离子交换活性测定 | 第82-83页 |
| 3 结果与分析 | 第83-98页 |
| 3.1 海马齿SpAHA1基因克隆 | 第83-84页 |
| 3.1.1 海马齿SpAHA1基因中间片段克隆 | 第83页 |
| 3.1.2 海马齿SpAHA1基因 3’-末端扩增 | 第83页 |
| 3.1.3 海马齿SpAHA1基因 5’-末端扩增 | 第83页 |
| 3.1.4 海马齿SpAHA1基因全长扩增 | 第83-84页 |
| 3.2 海马齿SpAHA1蛋白的生物信息学分析 | 第84-85页 |
| 3.3 不同胁迫下SpAHA1基因的表达模式分析 | 第85-90页 |
| 3.3.1 盐胁迫下SpAHA1基因的表达分析 | 第85-87页 |
| 3.3.1.1 盐胁迫下SpAHA1基因在根中的表达分析 | 第85-86页 |
| 3.3.1.2 盐胁迫下SpAHA1基因在茎中的表达分析 | 第86-87页 |
| 3.3.1.3 盐胁迫下SpAHA1基因在叶中的表达分析 | 第87页 |
| 3.3.2 不同温度条件下SpAHA1基因的表达分析 | 第87-88页 |
| 3.3.3 ABA胁迫下SpAHA1基因的表达分析 | 第88-89页 |
| 3.3.4 干旱胁迫下SpAHA1基因的表达分析 | 第89页 |
| 3.3.5 氧化胁迫下SpAHA1基因的表达分析 | 第89-90页 |
| 3.4 SpAHA1蛋白的亚细胞定位 | 第90-91页 |
| 3.4.1 SpAHA1基因定位表达载体的构建 | 第90-91页 |
| 3.4.2 烟草叶片中的定位 | 第91页 |
| 3.5 转基因酵母耐盐性鉴定 | 第91-93页 |
| 3.5.1 SpAHA1酵母表达载体的构建 | 第91-92页 |
| 3.5.2 酵母功能互补实验 | 第92-93页 |
| 3.6 转基因酵母离子含量测定 | 第93-94页 |
| 3.7 H~+-ATPase活性和Na~+/H~+离子交换活性测定 | 第94-98页 |
| 3.7.1 质膜纯度鉴定 | 第94-95页 |
| 3.7.2 H~+-ATPase酶活性测定 | 第95-96页 |
| 3.7.3 Na~+/H~+交换活性测定 | 第96-98页 |
| 4 讨论 | 第98-99页 |
| 5 本章小结 | 第99-100页 |
| 第四章 SpSOS1 C-末端功能域分析及高耐盐突变体筛选 | 第100-127页 |
| 1 研究背景 | 第100-101页 |
| 2 材料与方法 | 第101-104页 |
| 2.1 实验材料 | 第101页 |
| 2.2 实验方法 | 第101-104页 |
| 2.2.1 SpSOS1高耐盐突变体筛选 | 第101-102页 |
| 2.2.1.1 克隆SpSOS1基因的 3’-末端缺失突变基因所用到的引物 | 第101-102页 |
| 2.2.1.2 酵母表达载体的构建 | 第102页 |
| 2.2.1.3 酵母转化实验 | 第102页 |
| 2.2.1.4 酵母功能互补实验 | 第102页 |
| 2.2.1.5 转基因酵母离子含量测定 | 第102页 |
| 2.2.2 SpSOS1 C-末端功能域分析 | 第102-104页 |
| 2.2.2.1 AtSOS2和AtSOS2/3 调控SpSOS1 | 第102-103页 |
| 2.2.2.2 AtSOS2和AtSOS2/3 调控SpSOS1 C-末端缺失突变体 | 第103页 |
| 2.2.2.3 AtSOS2与AtCBLs互作后调控SpSOS1的活性 | 第103-104页 |
| 2.2.2.4 AtSOS2与其它AtCBLs调控SpSOS1 C-末端缺失突变体 | 第104页 |
| 3 结果与分析 | 第104-123页 |
| 3.1 SpSOS13’-末端缺失突变基因克隆 | 第104页 |
| 3.2 SpSOS13’-末端缺失突变基因酵母表达载体构建 | 第104-105页 |
| 3.3 SpSOS1 C-末端缺失突变体在酵母中的功能分析 | 第105-106页 |
| 3.4 SpSOS1 C-末端高耐盐突变体筛选 | 第106-109页 |
| 3.5 SpSOS1高耐盐突变体在转基因酵母中的离子含量测定 | 第109-110页 |
| 3.6 拟南芥AtSOS2和AtSOS2/3 对SpSOS1的调控 | 第110-112页 |
| 3.7 拟南芥AtSOS2和AtSOS2/3 调控SpSOS1的功能研究 | 第112-115页 |
| 3.8 拟南芥AtSOS2和AtSOS2/3 对SpSOS1蛋白C-末端缺失突变体的调控 | 第115-117页 |
| 3.9 AtSOS2与AtCBLs互作后调控SpSOS1的活性 | 第117-120页 |
| 3.9.1 AtSOS2和AtCBLs共表达后调控SpSOS1活性 | 第117-119页 |
| 3.9.2 AtSOS2和AtCBLs共表达后调控SpSOS1突变体活性 | 第119-120页 |
| 3.10 AtSOS2与AtCB10互作后调控SpSOS1的功能研究 | 第120-123页 |
| 3.10.1 AtSOS2与AtCB10互作后调控SpSOS1及DSPS位点 | 第120-121页 |
| 3.10.2 AtSOS2与AtCB10调控SpSOS1蛋白的C-末端缺失突变体 | 第121-123页 |
| 4 讨论 | 第123-126页 |
| 5 本章小结 | 第126-127页 |
| 第五章 海马齿钙结合蛋白SpCBL10与蛋白激酶SpCIPK8互作调控SpSOS1活性 | 第127-176页 |
| 1 研究背景 | 第127-129页 |
| 2 材料与方法 | 第129-138页 |
| 2.1 实验材料 | 第129页 |
| 2.2 海马齿SpCBL10和SpCIPK8基因的克隆 | 第129-130页 |
| 2.2.1 SpCBL10和SpCIPK8基因的同源克隆 | 第129页 |
| 2.2.2 SpCBL10和SpCIPK8基因 3’-末端扩增 | 第129页 |
| 2.2.3 SpCBL10和SpCIPK8基因 5’-末端扩增 | 第129-130页 |
| 2.2.4 SpCBL10和SpCIPK8基因全长片段克隆 | 第130页 |
| 2.3 SpCBL10和SpCIPK8基因的表达模式分析 | 第130-131页 |
| 2.3.1 实时荧光定量PCR引物设计 | 第130-131页 |
| 2.3.2 实时荧光定量PCR反应体系及条件 | 第131页 |
| 2.4 海马齿SpCBL10和SpCIPK8的亚细胞定位 | 第131页 |
| 2.5 海马齿SpCBL10和SpCIPK8的酵母双杂交 | 第131-133页 |
| 2.5.1 酵母双杂交表达载体构建 | 第131页 |
| 2.5.2 酵母双杂交感受态制备 | 第131-132页 |
| 2.5.3 酵母双杂交质粒转化及检测 | 第132页 |
| 2.5.4 融合蛋白的自激活活性检测 | 第132页 |
| 2.5.5 SpCBL10和SpCIPK8的酵母双杂交 | 第132-133页 |
| 2.5.6 SpCBL10和SpCIPK8互作区域研究 | 第133页 |
| 2.6 海马齿SpCBL10和SpCIPK8的双分子荧光互补实验 | 第133-135页 |
| 2.6.1 BiFC表达载体构建 | 第133-134页 |
| 2.6.2 CsCl法提取质粒DNA | 第134-135页 |
| 2.6.3 烟草原生质体制备 | 第135页 |
| 2.6.4 PEG法转化烟草原生质体 | 第135页 |
| 2.7 SpCIPK8调控SpSOS1活性 | 第135-136页 |
| 2.7.1 酵母表达载体构建 | 第135页 |
| 2.7.2 SpCIPK8调控SpSOS1活性 | 第135-136页 |
| 2.8 SpCBL10和SpCIPK8互作后调控SpSOS1活性 | 第136-137页 |
| 2.8.1 SpCIPK8/SpCBL10-p414酵母表达载体构建 | 第136页 |
| 2.8.2 酵母功能互补试验 | 第136-137页 |
| 2.8.3 酵母离子含量测定 | 第137页 |
| 2.9 SpCIPK8-306和蛋白磷酸酶调控SpSOS1及其突变体活性 | 第137-138页 |
| 2.9.1 拟南芥蛋白磷酸酶基因克隆 | 第137页 |
| 2.9.2 SpCIPK8-306与蛋白磷酸酶基因共表达酵母表达载体的构建 | 第137页 |
| 2.9.3 SpCIPK8-306与蛋白磷酸酶共表达调控SpSOS1活性 | 第137-138页 |
| 3 结果与分析 | 第138-170页 |
| 3.1 拟南芥AtCIPK8/AtCBL10参与SOS1蛋白的调控 | 第138-139页 |
| 3.2 海马齿SpCBL10和SpCIPK8基因的克隆 | 第139页 |
| 3.3 SpCBL10和SpCIPK8蛋白的生物信息学分析 | 第139-146页 |
| 3.3.1 SpCBL10和SpCIPK8蛋白的理化性质分析 | 第139-140页 |
| 3.3.2 SpCBL10和SpCIPK8蛋白的跨膜结构分析 | 第140页 |
| 3.3.3 SpCBL10和SpCIPK8蛋白的亲水性/疏水性分析 | 第140-141页 |
| 3.3.4 SpCBL10和SpCIPK8蛋白的进化树分析 | 第141-142页 |
| 3.3.5 SpCBL10和SpCIPK8蛋白的结构域分析 | 第142-144页 |
| 3.3.6 SpCBL10和SpCIPK8蛋白的 3D结构建模 | 第144-146页 |
| 3.4 SpCBL10和SpCIPK8基因的表达模式分析 | 第146-148页 |
| 3.4.1 盐胁迫下SpCBL10和SpCIPK8基因在根中的表达分析 | 第146页 |
| 3.4.2 盐胁迫下SpCBL10和SpCIPK8基因在茎中的表达分析 | 第146-147页 |
| 3.4.3 盐胁迫下SpCBL10和SpCIPK8基因在叶中的表达分析 | 第147-148页 |
| 3.5 SpCBL10和SpCIPK8蛋白的亚细胞定位 | 第148-149页 |
| 3.5.1 SpCBL10和SpCIPK8基因定位表达载体的构建 | 第148页 |
| 3.5.2 SpCBL10和SpCIPK8在烟草叶片中的定位 | 第148-149页 |
| 3.6 SpCBL10和SpCIPK8的酵母双杂交 | 第149-154页 |
| 3.6.1 酵母双杂交表达载体构建 | 第149-150页 |
| 3.6.2 SpCBL10和SpCIPK8的互作实验 | 第150-151页 |
| 3.6.3 SpCBL10和SpCIPK8缺失突变体的互作实验 | 第151-153页 |
| 3.6.4 SpCIPK8和SpCBL10缺失突变体的互作实验 | 第153-154页 |
| 3.7 海马齿SpCBL10和SpCIPK8的双分子荧光互补实验 | 第154-156页 |
| 3.7.1 BiFC表达载体构建 | 第154-155页 |
| 3.7.2 BiFC实验 | 第155-156页 |
| 3.8 SpCIPK8调控SpSOS1活性 | 第156-162页 |
| 3.8.1 SpCIPK8和SpCIPK8-306酵母表达载体构建 | 第156-157页 |
| 3.8.2 SpCIPK8和SpCIPK8-306调控SpSOS1活性 | 第157-159页 |
| 3.8.3 SpCIPK8-306K38N突变体调控SpSOS1活性 | 第159页 |
| 3.8.4 酵母离子含量测定 | 第159-161页 |
| 3.8.5 SpCIPK8调控SpSOS1的功能域分析 | 第161-162页 |
| 3.9 SpCBL10和SpCIPK8互作后调控SpSOS1活性 | 第162-165页 |
| 3.9.1 SpCIPK8/SpCBL10-p414酵母表达载体构建 | 第162-163页 |
| 3.9.2 SpCIPK8和SpCBL10互作后调控SpSOS1活性 | 第163-164页 |
| 3.9.3 酵母离子含量测定 | 第164-165页 |
| 3.10 SpCIPK8和蛋白磷酸酶互作后调控SpSOS1的活性 | 第165-170页 |
| 3.10.1 蛋白磷酸酶基因克隆 | 第165页 |
| 3.10.2 酵母表达载体构建 | 第165-166页 |
| 3.10.3 蛋白磷酸酶与SpCIPK8-306蛋白激酶作用后调节SpSOS1活性 | 第166-168页 |
| 3.10.4 转基因酵母离子含量测定 | 第168-170页 |
| 4 讨论 | 第170-175页 |
| 5 本章小结 | 第175-176页 |
| 全文总结 | 第176-178页 |
| 参考文献 | 第178-197页 |
| 附录 | 第197-201页 |
| 博士期间发表的主要论文 | 第201-202页 |
| 致谢 | 第202-203页 |
