| 本研究工作创新点 | 第7-11页 |
| 中文摘要 | 第11-13页 |
| Abstract | 第13-15页 |
| 引言 | 第16-18页 |
| 第一章 文献综述 | 第18-45页 |
| 1 甲壳类免疫系统 | 第18-24页 |
| 1.1 细胞免疫 | 第18-21页 |
| 1.2 体液免疫 | 第21-24页 |
| 1.2.1 抗菌肽 | 第22页 |
| 1.2.2 酚氧化酶原激活系统 | 第22-23页 |
| 1.2.3 凝集素及补体因子 | 第23-24页 |
| 2. 凝集素 | 第24-31页 |
| 2.1 C-型凝集素的结构特征 | 第24-26页 |
| 2.2 无脊椎动物C-型凝集素功能研究 | 第26-31页 |
| 3. 对虾主要病害 | 第31-39页 |
| 3.1 弧菌 | 第31页 |
| 3.2 白斑综合征病毒 | 第31-39页 |
| 3.2.1 WSSV形态与结构 | 第32页 |
| 3.2.2 WSSV蛋白 | 第32-34页 |
| 3.2.3 WSSV的宿主及传播途径 | 第34-35页 |
| 3.2.4 WSSV防治 | 第35-39页 |
| 3.2.4.1 疫苗 | 第35-37页 |
| 3.2.4.1.1 灭活疫苗 | 第35-36页 |
| 3.2.4.1.2 蛋白质亚单位疫苗 | 第36页 |
| 3.2.4.1.3 DNA疫苗 | 第36-37页 |
| 3.2.4.2 抗体中和 | 第37页 |
| 3.2.4.3 RNA干扰 | 第37-38页 |
| 3.2.4.4 免疫增强剂 | 第38-39页 |
| 4 蛋白转导域的研究进展 | 第39-44页 |
| 4.1 TAT穿膜肽 | 第39-40页 |
| 4.2 TAT的入胞机制 | 第40-44页 |
| 4.2.1 非内吞途径 | 第42页 |
| 4.2.2 内吞途径 | 第42-44页 |
| 5 本研究的目的及意义 | 第44-45页 |
| 第二章 实验材料与方法 | 第45-69页 |
| 1 实验材料 | 第45-50页 |
| 1.1 质粒及菌株等 | 第45页 |
| 1.2 实验试剂及仪器 | 第45-46页 |
| 1.3 实验动物 | 第46页 |
| 1.4 培养基的配制 | 第46页 |
| 1.5 提取WSSV所用溶液 | 第46页 |
| 1.6 普通琼脂糖电泳缓冲液 | 第46-47页 |
| 1.7 甲醛变性琼脂糖凝胶所用溶液 | 第47页 |
| 1.8 聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳相关溶液 | 第47页 |
| 1.9 Ni-NTA柱变性纯化所用溶液 | 第47-48页 |
| 1.10 ProteinA 亲和层析相关溶液 | 第48页 |
| 1.11 Western Blot相关溶液 | 第48-49页 |
| 1.12 凝集实验相关溶液 | 第49页 |
| 1.13 其他溶液 | 第49页 |
| 1.14 引物 | 第49-50页 |
| 2 实验方法 | 第50-69页 |
| 2.1 WSSV提取及病毒滴定 | 第50-51页 |
| 2.1.1 WSSV提纯 | 第50页 |
| 2.1.2 病毒滴定 | 第50-51页 |
| 2.2 弧菌活化及计数 | 第51页 |
| 2.3 病原免疫克氏原螯虾 | 第51页 |
| 2.4 RNA提取 | 第51-52页 |
| 2.5 甲醛变性琼脂糖凝胶电泳 | 第52页 |
| 2.6 cDNA合成 | 第52-53页 |
| 2.7 PCR及实时荧光定量RT-PCR | 第53页 |
| 2.8 PcLT重组蛋白表达和纯化 | 第53-55页 |
| 2.8.1 基因工程表达菌株制备 | 第53-54页 |
| 2.8.2 PcLT重组蛋白表达及鉴定 | 第54页 |
| 2.8.3 PcLT重组蛋白的纯化 | 第54-55页 |
| 2.9 PcLT多克隆抗体的制备及纯化 | 第55-56页 |
| 2.10 Western blot检测PcLT蛋白在组织中的分布及定量 | 第56-57页 |
| 2.10.1 定性检测PcLT蛋白在组织中的分布 | 第56-57页 |
| 2.10.2 定量检测PcLT蛋白在组织中的含量 | 第57页 |
| 2.11 rPcLT的活性检测 | 第57-60页 |
| 2.11.1 微生物凝集实验 | 第57-58页 |
| 2.11.2 特异性糖结合实验 | 第58页 |
| 2.11.3 rPcLT抑菌活性 | 第58-59页 |
| 2.11.3.1 MTT法测抑菌活性 | 第58-59页 |
| 2.11.3.2 滤纸片法测杀菌活性 | 第59页 |
| 2.11.4 rPcLT结合微生物活性 | 第59-60页 |
| 2.11.4.1 rPcLT结合弧菌 | 第59页 |
| 2.11.4.2 rPcLT结合WSSV | 第59-60页 |
| 2.11.4.3 rPcLT结合WSSV病毒囊膜蛋白 | 第60页 |
| 2.12 rPcLT对虾体内体液免疫的影响 | 第60-62页 |
| 2.12.1 过氧素(peroxinectin)mRNA水平的变化 | 第60-61页 |
| 2.12.2 酚氧化酶(PO)活力测定 | 第61页 |
| 2.12.3 超氧化物歧化酶(SOD)酶活力测定 | 第61-62页 |
| 2.13 rPcLT对细胞免疫的影响 | 第62-63页 |
| 2.13.1 流式细胞术检测血细胞的吞噬率 | 第62页 |
| 2.13.2 激光共聚焦检测血细胞的吞噬指数 | 第62-63页 |
| 2.14 rPcLT结合血细胞实验 | 第63页 |
| 2.15 rPcLT体内清除弧菌实验 | 第63-64页 |
| 2.16 rPcLT对WSSV的作用 | 第64-65页 |
| 2.16.1 对病毒攻击的保护作用 | 第64页 |
| 2.16.2 rPcLT阻止病毒感染实验 | 第64-65页 |
| 2.17 ptd-pclt基因克隆 | 第65-68页 |
| 2.17.1 全长基因的制备 | 第65-66页 |
| 2.17.2 PCR产物回收 | 第66页 |
| 2.17.3 目的基因及载体酶切 | 第66-67页 |
| 2.17.4 目的基因与表达载体连接 | 第67页 |
| 2.17.5 重组载体转入克隆菌株JM109 | 第67-68页 |
| 2.17.6 ptd-pclt-egfp及pclt-egfp克隆 | 第68页 |
| 2.18 PTD-PcLT、PTD-PcLT-eGFP、PcLT-eGPF重组蛋白表达、纯化及活性鉴定 | 第68页 |
| 2.19 荧光免疫组织化学检测 | 第68-69页 |
| 第三章 实验结果分析 | 第69-93页 |
| 1 pclt全长序列分析 | 第69-70页 |
| 2 pclt表达模式分析 | 第70-71页 |
| 3 重组蛋白的表达、纯化与鉴定 | 第71-73页 |
| 4 蛋白水平上的表达模式分析 | 第73-75页 |
| 4.1 定性检测 | 第73页 |
| 4.2 定量检测 | 第73-75页 |
| 5 重组蛋白rPcLT的活性检测 | 第75-80页 |
| 5.1 重组蛋白rPcLT具备凝集活性 | 第75页 |
| 5.2 重组蛋白rPcLT特异性糖结合活性 | 第75-76页 |
| 5.3 重组蛋白rPcLT不具备抗细菌活性 | 第76-77页 |
| 5.4 重组蛋白rPcLT结合微生物活性 | 第77-80页 |
| 5.4.1 重组蛋白rPcLT结合弧菌 | 第77-78页 |
| 5.4.2 重组蛋白rPcLT结合WSSV病毒粒子及囊膜蛋白 | 第78-80页 |
| 6 rPcLT激活体液免疫 | 第80-83页 |
| 6.1 peroxinectin(PXN)mRNA水平提高 | 第80-81页 |
| 6.2 激活酚氧化酶(PO) | 第81-82页 |
| 6.3 超氧化物岐化酶(SOD)活力提高 | 第82-83页 |
| 7 rPcLT增强细胞吞噬作用 | 第83-86页 |
| 7.1 rPcLT增强血细胞吞噬率 | 第83-84页 |
| 7.2 rPcLT增强血细胞吞噬指数 | 第84-86页 |
| 8 rPcLT加快体内弧菌清除 | 第86-87页 |
| 9 rPcLT对病毒攻击的保护作用 | 第87-88页 |
| 10 rPcLT阻止病毒感染实验 | 第88-89页 |
| 11 pET-28a(+)-PTD-PcLT、pET-28a(+)-PcLT-eGFP、pET-28a(+)-PTD-PcLT-eGFP重组质粒的构建 | 第89-90页 |
| 12 重组蛋白的表达、纯化与鉴定 | 第90-92页 |
| 13 荧光免疫组织化学检测 | 第92-93页 |
| 第四章 讨论及展望 | 第93-98页 |
| 参考文献 | 第98-111页 |
| 研究生期间科研成果 | 第111-112页 |
| 致谢 | 第112页 |
