| 摘要 | 第8-10页 |
| ABSTRACT | 第10-11页 |
| 符号与缩略语说明 | 第12-14页 |
| 第一章 文献综述 | 第14-24页 |
| 1.1 引言 | 第14页 |
| 1.2 砷污染及其危害 | 第14-16页 |
| 1.2.1 砷污染现状及其成因 | 第14页 |
| 1.2.2 砷的形态与毒性 | 第14页 |
| 1.2.3 砷污染的危害 | 第14-15页 |
| 1.2.3.1 砷对植物的影响 | 第15页 |
| 1.2.3.2 砷对土壤微生物的影响 | 第15页 |
| 1.2.3.3 砷对人体的危害 | 第15页 |
| 1.2.4 砷污染修复研究进展 | 第15-16页 |
| 1.2.4.1 植物修复 | 第15-16页 |
| 1.2.4.2 微生物修复 | 第16页 |
| 1.2.4.3 微生物与植物联合修复 | 第16页 |
| 1.3 微生物的砷代谢机制 | 第16-19页 |
| 1.3.1 砷的氧化微生物 | 第16-17页 |
| 1.3.1.1 化能自养型微生物 | 第16页 |
| 1.3.1.2 化能异养型微生物 | 第16-17页 |
| 1.3.2 砷的还原 | 第17页 |
| 1.3.2.1 细胞质As(Ⅴ)还原微生物 | 第17页 |
| 1.3.2.2 呼吸性As(Ⅴ)还原微生物 | 第17页 |
| 1.3.3 砷的甲基化 | 第17-19页 |
| 1.3.3.1 砷的甲基化机制 | 第18页 |
| 1.3.3.2 砷的微生物甲基化 | 第18页 |
| 1.3.3.3 砷甲基转移酶ArsM | 第18-19页 |
| 1.3.3.4 甲基化研究进展 | 第19页 |
| 1.4 根瘤菌在砷污染修复中的作用 | 第19-21页 |
| 1.4.1 根瘤菌与固氮 | 第19-20页 |
| 1.4.2 根瘤菌形态与生理生化特性 | 第20页 |
| 1.4.3 根瘤菌进入植物的途径 | 第20页 |
| 1.4.4 根瘤菌对重金属的吸收和转化 | 第20-21页 |
| 1.5 研究目的与意义 | 第21页 |
| 1.6 主要研究内容 | 第21-22页 |
| 1.7 技术路线 | 第22-24页 |
| 第二章 Pseudomonas alcaligenes中PaarsM基因功能的鉴定和异源表达 | 第24-50页 |
| 前言 | 第24页 |
| 2.1 材料与方法 | 第24-36页 |
| 2.1.1 假单胞菌P. alcaligenes对As(Ⅲ)的转化 | 第26页 |
| 2.1.2 假单胞菌P. alcaligenes对As(Ⅴ)的转化 | 第26页 |
| 2.1.3 PaarsM基因的功能分析与蛋白序列比对 | 第26页 |
| 2.1.4 菌株中砷甲基化基因在转录水平上的表达 | 第26-27页 |
| 2.1.4.1 菌体RNA的提取 | 第26-27页 |
| 2.1.4.2 RNA的消化与反转录 | 第27页 |
| 2.1.4.3 QRT-PCR | 第27页 |
| 2.1.5 P.alcaligenes体内砷甲基转移酶的克隆 | 第27-28页 |
| 2.1.5.1 基因组DNA的提取 | 第27-28页 |
| 2.1.5.2 P. alcaligenes菌株中PaarsM基因的克隆 | 第28页 |
| 2.1.6 假单胞菌arsM基因敲除突变株的构建 | 第28-29页 |
| 2.1.7 PaarsM基因提高假单胞菌对As(Ⅲ)抗性的研究 | 第29页 |
| 2.1.8 表达PaarsM基因的E.coli的As(Ⅲ)抗性分析和砷甲基化能力检测 | 第29-30页 |
| 2.1.8.1 表达质粒pET29a-PaarsM的构建 | 第29-30页 |
| 2.1.8.2 E.coli AW3110(DE3) (ΔarsRBC)感受态细胞的转化 | 第30页 |
| 2.1.8.3 表达PaarsM基因的E.coli AW3110菌株对As(Ⅲ)的抗性分析 | 第30页 |
| 2.1.8.4 表达PaarsM基因的E.coli的砷甲基化能力 | 第30页 |
| 2.1.9 P.alcaligenes甲基化蛋白PaArsM的纯化和体外酶活性分析 | 第30-34页 |
| 2.1.9.1 重组菌株BL21(DE3)的诱导表达 | 第30-31页 |
| 2.1.9.2 表达蛋白的Ni-NTA亲和层析纯化 | 第31页 |
| 2.1.9.3 SDS-PAGE电泳 | 第31-32页 |
| 2.1.9.4 目标蛋白浓度的计算和测定 | 第32-33页 |
| 2.1.9.5 纯化蛋白的砷甲基化能力的体外检测 | 第33-34页 |
| 2.1.10 P.alcaligenes菌株和PaArsM蛋白挥发砷的气态收集 | 第34-35页 |
| 2.1.11 砷形态分析 | 第35-36页 |
| 2.2 结果与分析 | 第36-47页 |
| 2.2.1 菌株P. alcaligenes对As(Ⅲ)的甲基化结果 | 第36-38页 |
| 2.2.2 菌株P. alcaligenes对As(Ⅴ)的甲基化结果 | 第38-39页 |
| 2.2.3 PaarsM基因的功能分析 | 第39-41页 |
| 2.2.4 PaarsM基因在转录水平上的表达 | 第41页 |
| 2.2.5 P.alcaligenes中砷甲基化酶基因的克隆和敲除 | 第41-42页 |
| 2.2.6 PaarsM基因提高假单胞菌对As(Ⅲ)抗性的研究 | 第42页 |
| 2.2.7 PaarsM基因赋予砷敏感大肠杆菌As(Ⅲ)抗性的研究 | 第42-43页 |
| 2.2.8 表达PaarsM基因的大肠杆菌的As(Ⅲ)甲基化结果 | 第43-44页 |
| 2.2.9 纯化PaArsM蛋白的体外活性研究 | 第44-47页 |
| 2.3 讨论 | 第47-48页 |
| 2.4 本章小结 | 第48-50页 |
| 第三章 基因工程根瘤菌的构建和砷甲基化功能的鉴定 | 第50-58页 |
| 前言 | 第50页 |
| 3.1 材料与方法 | 第50-53页 |
| 3.1.1 CrarsM基因的克隆 | 第50-51页 |
| 3.1.2 二亲接合构建重组根瘤菌 | 第51页 |
| 3.1.3 重组根瘤菌的CrarsM基因和nif基因的克隆 | 第51-52页 |
| 3.1.4 重组根瘤菌As(Ⅲ)抗性检测 | 第52页 |
| 3.1.5 重组根瘤菌对As(Ⅲ)的甲基化能力检测 | 第52页 |
| 3.1.6 重组根瘤菌挥发气态砷能力的检测 | 第52-53页 |
| 3.2 结果与分析 | 第53-57页 |
| 3.2.1 重组根瘤菌的CrarsM基因和nif基因的克隆结果 | 第53-54页 |
| 3.2.2 重组根瘤菌的As(Ⅲ)抗性实验结果 | 第54-55页 |
| 3.2.3 重组根瘤菌对As(Ⅲ)的甲基化结果 | 第55-56页 |
| 3.2.4 重组根瘤菌挥发气态砷能力检测结果 | 第56-57页 |
| 3.3 讨论 | 第57页 |
| 3.4 本章小结 | 第57-58页 |
| 第四章 重组根瘤菌与植物共生对砷的转化 | 第58-64页 |
| 前言 | 第58页 |
| 4.1 材料与方法 | 第58-59页 |
| 4.1.1 实验材料 | 第58页 |
| 4.1.2 试管无菌培养实验 | 第58-59页 |
| 4.1.2.1 试管无菌培养三叶草方法 | 第58页 |
| 4.1.2.2 植物样品处理方法 | 第58-59页 |
| 4.1.3 蛭石盆栽实验 | 第59页 |
| 4.1.3.1 蛭石栽培三叶草方法 | 第59页 |
| 4.1.3.2 蛭石盆栽三叶草对无机As(Ⅲ)的转化 | 第59页 |
| 4.1.4 砷形态分析 | 第59页 |
| 4.2 结果与分析 | 第59-63页 |
| 4.2.1 试管栽培实验结果 | 第59-61页 |
| 4.2.1.1 三叶草在As(Ⅲ)处理下的生物量 | 第59-60页 |
| 4.2.1.2 三叶草不同组织中的砷形态 | 第60-61页 |
| 4.2.2 蛭石盆栽实验结果 | 第61-63页 |
| 4.2.2.1 三叶草在As(Ⅲ)处理下的生物量 | 第61-62页 |
| 4.2.2.2 三叶草不同组织中的砷形态 | 第62-63页 |
| 4.3 讨论 | 第63页 |
| 4.4 本章小结 | 第63-64页 |
| 第五章 全文结论及研究展望 | 第64-66页 |
| 5.1 全文结论 | 第64页 |
| 5.1.1 PaarsM基因功能的鉴定 | 第64页 |
| 5.1.2 基因工程根瘤菌的构建和砷甲基化能力检测 | 第64页 |
| 5.1.3 根瘤菌-豆科植物在砷处理条件下的生长与转化 | 第64页 |
| 5.2 创新点 | 第64页 |
| 5.3 可能存在的问题 | 第64-65页 |
| 5.4 研究展望 | 第65-66页 |
| 参考文献 | 第66-74页 |
| 附录 | 第74-78页 |
| 致谢 | 第78-80页 |
| 作者简历 | 第80页 |
