| 符号说明 | 第5-11页 |
| 中文摘要 | 第11-14页 |
| Abstract | 第14-16页 |
| 1 前言 | 第17-37页 |
| 1.1 氮素研究的意义 | 第17-19页 |
| 1.1.1 氮素对植物生长发育的影响 | 第17-18页 |
| 1.1.2 氮肥施用现状及造成的环境危害 | 第18-19页 |
| 1.2 植物对氮素吸收利用的分子机理 | 第19-26页 |
| 1.2.1 NRT1转运蛋白家族 | 第20-22页 |
| 1.2.2 NRT2转运蛋白家族 | 第22-23页 |
| 1.2.3 CLC转运蛋白家族 | 第23页 |
| 1.2.4 SLAC/SLAH转运蛋白家族 | 第23-24页 |
| 1.2.5 植物对NH_4~+的吸收 | 第24-25页 |
| 1.2.6 植物体内NO_3~-的同化 | 第25-26页 |
| 1.3 NO_3~-调控基因的研究 | 第26-35页 |
| 1.3.1 调控NO_3~-短期效应的基因 | 第27-32页 |
| 1.3.1.1 NO_3~-感应子 | 第27页 |
| 1.3.1.2 蛋白激酶 | 第27-29页 |
| 1.3.1.3 转录因子 | 第29-31页 |
| 1.3.1.4 NRG2在NO_3~-信号途径中的作用 | 第31-32页 |
| 1.3.2 调控NO_3~-长期效应的基因 | 第32-35页 |
| 1.4 本研究的目的及意义 | 第35-37页 |
| 2 材料与方法 | 第37-59页 |
| 2.1 实验材料 | 第37-43页 |
| 2.1.1 植物材料 | 第37页 |
| 2.1.2 菌株与质粒 | 第37页 |
| 2.1.3 酶与试剂 | 第37-41页 |
| 2.1.3.1 酶 | 第37页 |
| 2.1.3.2 试剂 | 第37-38页 |
| 2.1.3.3 试剂盒 | 第38页 |
| 2.1.3.4 溶液、缓冲液及培养基配方 | 第38-41页 |
| 2.1.4 仪器与设备 | 第41页 |
| 2.1.5 引物 | 第41-43页 |
| 2.2 实验方法 | 第43-59页 |
| 2.2.1 植物材料培养及拟南芥的生长 | 第43-45页 |
| 2.2.1.1 培养基配制 | 第43页 |
| 2.2.1.2 种子消毒处理 | 第43-44页 |
| 2.2.1.3 拟南芥的竖直培养 | 第44页 |
| 2.2.1.4 拟南芥的六孔板培养 | 第44页 |
| 2.2.1.5 拟南芥的Magenta Box培养 | 第44-45页 |
| 2.2.1.6 拟南芥的正常生长 | 第45页 |
| 2.2.2 双突变体的构建 | 第45-46页 |
| 2.2.2.1 拟南芥的杂交 | 第45页 |
| 2.2.2.2 拟南芥基因组提取 | 第45-46页 |
| 2.2.2.3 PCR扩增 | 第46页 |
| 2.2.3 构建转基因株系表达载体 | 第46-50页 |
| 2.2.3.1 植物总RNA的提取 | 第46-47页 |
| 2.2.3.2 反转录 | 第47页 |
| 2.2.3.3 Phusion PCR扩增 | 第47-48页 |
| 2.2.3.4 PCR产物回收(试剂盒法) | 第48页 |
| 2.2.3.5 TOPO连接反应 | 第48页 |
| 2.2.3.6 大肠杆菌感受态的制备 | 第48-49页 |
| 2.2.3.7 大肠杆菌感受态细胞的转化 | 第49页 |
| 2.2.3.8 质粒提取 | 第49-50页 |
| 2.2.3.9 DNA序列的测定 | 第50页 |
| 2.2.3.10 LR反应 | 第50页 |
| 2.2.3.11 质粒DNA的酶切鉴定 | 第50页 |
| 2.2.4 农杆菌介导的拟南芥的遗传转化 | 第50-52页 |
| 2.2.4.1 根癌农杆菌GV3101感受态细胞的制备 | 第50-51页 |
| 2.2.4.2 表达载体转化农杆菌 | 第51页 |
| 2.2.4.3 拟南芥的转化 | 第51-52页 |
| 2.2.5 qPCR实验技术 | 第52页 |
| 2.2.6 硝态氮含量测定 | 第52-54页 |
| 2.2.7 NR活性的测定 | 第54-55页 |
| 2.2.7.1 标准曲线的制作 | 第54-55页 |
| 2.2.7.2 样品中NR活性的测定 | 第55页 |
| 2.2.8 染色体免疫共沉淀技术(ChIP) | 第55-57页 |
| 2.2.8.1 染色体与蛋白交联(室温) | 第56页 |
| 2.2.8.2 染色体准备(4℃) | 第56页 |
| 2.2.8.3 免疫共沉淀 | 第56页 |
| 2.2.8.4 Elution和解交联(4℃和室温) | 第56-57页 |
| 2.2.8.5 清洗DNA(室温) | 第57页 |
| 2.2.9 电泳迁移率变动分析(EMSA) | 第57-59页 |
| 3 结果与分析 | 第59-90页 |
| 3.1 拟南芥NRG2基因的表达与定位 | 第59-61页 |
| 3.1.1 NRG2基因在不同氮素处理下的表达分析 | 第59-60页 |
| 3.1.2 NO_3~-对NRG2蛋白定位的影响 | 第60-61页 |
| 3.2 NRG2对NO_3~-积累及同化的调控 | 第61-64页 |
| 3.2.1 NRG2对NO_3~-积累的影响 | 第61-63页 |
| 3.2.2 NRG2对NO_3~-同化的影响 | 第63-64页 |
| 3.3 NRG2基因调控NRT1.1的遗传学分析 | 第64-68页 |
| 3.3.1 利用双突变体chl1-13 nrg2-2研究NRG2对NRT1.1的调控 | 第64-66页 |
| 3.3.1.1 双突变体chl1-13 nrg2-2中NO_3~-含量测定 | 第64-65页 |
| 3.3.1.2 双突变体chl1-13 nrg2-2中NO_3~-诱导基因的表达 | 第65-66页 |
| 3.3.2 利用转基因株系NRT1.1/nrg2-2研究NRG2对NRT1.1的调控 | 第66-68页 |
| 3.3.2.1 转基因株系NRT1.1/nrg2-2中NRT1.1的表达分析 | 第66-67页 |
| 3.3.2.2 转基因株系NRT1.1/nrg2-2中的NO_3~-含量测定 | 第67-68页 |
| 3.3.2.3 转基因株系NRT1.1/nrg2-2中的NO_3~-诱导基因表达 | 第68页 |
| 3.4 nrg2-2和chl1-13突变体的转录组分析 | 第68-71页 |
| 3.4.1 测序数据质量评估 | 第68-69页 |
| 3.4.2 差异表达基因统计及GO分析 | 第69-71页 |
| 3.5 NRG2结合NRT1.1启动子的分析 | 第71-74页 |
| 3.5.1 NRG2家族的蛋白结构分析 | 第71-73页 |
| 3.5.2 NRG2与NRT1.1启动子结合的分析 | 第73-74页 |
| 3.6 NLP7基因调控NRT1.1的遗传学分析 | 第74-83页 |
| 3.6.1 NLP7基因调控NRT1.1基因表达检测 | 第74-76页 |
| 3.6.2 对双突变体chl1-13 nlp7-4的鉴定分析 | 第76-80页 |
| 3.6.2.1 双突变体chl1-13 nlp7-4的荧光表型检测 | 第76-77页 |
| 3.6.2.2 双突变体chl1-13 nlp7-4的NO_3~-含量检测 | 第77-78页 |
| 3.6.2.3 NLP7对NO_3~-积累及同化的调控 | 第78-80页 |
| 3.6.2.4 双突变体chl1-13 nlp7-4中NR活性的检测 | 第80页 |
| 3.6.3 对转基因株系NRT1.1/nlp7-4的鉴定分析 | 第80-83页 |
| 3.6.3.1 转基因株系NRT1.1/nlp7-4中NRT1.1的表达分析 | 第80-81页 |
| 3.6.3.2 转基因株系NRT1.1/nlp7-4的荧光表型检测 | 第81-82页 |
| 3.6.3.3 转基因株系NRT1.1/nlp7-4的NO_3~-含量及NR活性检测 | 第82-83页 |
| 3.6.3.4 NRT1.1/nlp7-4互补株系中NO_3~-诱导基因的表达 | 第83页 |
| 3.7 chl1-13和nlp7-4突变体的转录组分析 | 第83-87页 |
| 3.7.1 测序数据质量评估 | 第84页 |
| 3.7.2 差异表达基因统计及GO分析 | 第84-87页 |
| 3.8 NLP7结合NRT1.1的启动子的分析 | 第87-90页 |
| 3.8.1 ChIP实验证明NLP7与NRT1.1启动子的结合 | 第87-88页 |
| 3.8.2 EMSA实验证明NLP7与NRT1.1启动子的结合 | 第88-90页 |
| 4 讨论 | 第90-94页 |
| 4.1 NRG2不受氮素的调控 | 第90页 |
| 4.2 NRG2与NRT1.1的调控关系 | 第90-91页 |
| 4.3 NLP7与NRT1.1的调控关系 | 第91-94页 |
| 5 结论 | 第94-95页 |
| 参考文献 | 第95-106页 |
| 致谢 | 第106-107页 |
| 攻读学位期间发表的论文及成果 | 第107页 |
