| 摘要 | 第3-6页 |
| ABSTRACT | 第6-9页 |
| 第一章 概述 | 第14-24页 |
| 1.1 舞毒蛾—农业害虫 | 第14页 |
| 1.2 几丁质 | 第14-15页 |
| 1.2.1 几丁质结构与功能 | 第14-15页 |
| 1.2.2 几丁质的应用 | 第15页 |
| 1.3 几丁质酶 | 第15-16页 |
| 1.3.1 几丁质酶的多样性 | 第15-16页 |
| 1.3.2 生物体内几丁质酶的作用 | 第16页 |
| 1.3.3 几丁质酶的应用 | 第16页 |
| 1.4 昆虫几丁质酶 | 第16-18页 |
| 1.4.1 昆虫几丁质酶的性质和结构 | 第16页 |
| 1.4.2 昆虫几丁质酶的分类及功能 | 第16-18页 |
| 1.4.3 昆虫几丁质酶的生化特性与生理功能 | 第18页 |
| 1.4.4 昆虫几丁质酶的应用 | 第18页 |
| 1.5 Bac-to-Bac昆虫细胞系表达系统 | 第18-19页 |
| 1.6 定点突变技术的概述 | 第19-21页 |
| 1.7 昆虫几丁质酶的定点突变研究 | 第21页 |
| 1.8 本研究的目的及意义 | 第21页 |
| 1.9 本研究课题的主要来源和主要内容 | 第21-24页 |
| 第二章 表达系统的筛选 | 第24-48页 |
| 2.1 引言 | 第24页 |
| 2.2 实验材料 | 第24-30页 |
| 2.2.1 分子生物学试剂盒及试剂 | 第24-25页 |
| 2.2.2 相关溶液的配置 | 第25-26页 |
| 2.2.3 表达载体与菌株 | 第26-28页 |
| 2.2.4 实验设备与仪器 | 第28-30页 |
| 2.3 实验方法 | 第30-40页 |
| 2.3.1 引物的设计与合成 | 第30页 |
| 2.3.2 舞毒蛾Ⅰ型几丁质酶全长、催化区和无信号肽区序列扩增 | 第30-33页 |
| 2.3.3 重组表达载体构建 | 第33-36页 |
| 2.3.4 原核表达研究 | 第36-38页 |
| 2.3.5 真核表达研究 | 第38-40页 |
| 2.4 实验结果 | 第40-47页 |
| 2.4.1 质粒提取及LdCht5、LdCD、LdNSD的PCR产物胶回收结果 | 第40-41页 |
| 2.4.2 重组载体双酶切鉴定结果 | 第41-42页 |
| 2.4.3 真核表达载体的PCR鉴定结果 | 第42-43页 |
| 2.4.4 原核重组载体的诱导表达结果 | 第43-46页 |
| 2.4.5 真核重组杆粒的表达结果 | 第46-47页 |
| 2.5 讨论 | 第47-48页 |
| 第三章 舞毒蛾Ⅰ型几丁质酶催化区活性位点D143、D145、W146、E147的定点突变和表达纯化 | 第48-64页 |
| 3.1 引言 | 第48页 |
| 3.2 实验材料 | 第48-50页 |
| 3.2.1 分子生物学试剂盒及试剂 | 第48页 |
| 3.2.2 相关溶液的配置 | 第48-50页 |
| 3.2.3 实验仪器 | 第50页 |
| 3.3 实验方法 | 第50-57页 |
| 3.3.1 重组突变型舞毒蛾几丁质酶基因(W146G、D143E/W146G、D143E/D145E/W146G、D143E/D145E/W146GE147E)真核表达载体的重组构建 | 第50-54页 |
| 3.3.2 细胞培养 | 第54-56页 |
| 3.3.3 舞毒蛾几丁质酶突变体蛋白的表达及纯化 | 第56-57页 |
| 3.4 实验结果 | 第57-62页 |
| 3.4.1 含突变基因的重组穿梭载体构建鉴定结果 | 第57-58页 |
| 3.4.2 重组杆粒的构建 | 第58-59页 |
| 3.4.3 细胞驯化过程形态 | 第59-60页 |
| 3.4.4 重组杆状病毒的获得 | 第60-61页 |
| 3.4.5 Sf9细胞表达条件优化 | 第61-62页 |
| 3.4.6 突变型舞毒蛾几丁质酶蛋白W1460、D143E/W146G、D143E/D145E/W146G、D143E/D145E/W146GE147E的表达纯化 | 第62页 |
| 3.5 讨论 | 第62-64页 |
| 第四章 舞毒蛾Ⅰ型几丁质酶催化区活性位点D143、D145、W146、E147的酶学活性研究 | 第64-74页 |
| 4.1 引言 | 第64页 |
| 4.2 实验材料 | 第64-65页 |
| 4.2.1 分子生物学相关试剂及试剂盒 | 第64页 |
| 4.2.2 相关溶液的配置 | 第64页 |
| 4.2.3 实验仪器 | 第64-65页 |
| 4.3 实验方法 | 第65-67页 |
| 4.3.1 4-MU标准曲线的绘制 | 第65页 |
| 4.3.2 蛋白标准曲线浓度的绘制 | 第65-66页 |
| 4.3.3 几丁质酶活性的测定方法 | 第66页 |
| 4.3.4 最适pH及最适温度的测定 | 第66-67页 |
| 4.3.5 pH稳定性及热稳定性 | 第67页 |
| 4.4 实验结果 | 第67-72页 |
| 4.4.1 4-MU标准曲线 | 第67页 |
| 4.4.2 蛋白标准浓度曲线 | 第67-68页 |
| 4.4.3 突变型几丁质酶的活性分析 | 第68-69页 |
| 4.4.4 突变型几丁质酶最适pH的分析 | 第69页 |
| 4.4.5 突变型几丁质酶最适温度的分析 | 第69-70页 |
| 4.4.6 pH稳定性对酶相对活性的影响 | 第70-71页 |
| 4.4.7 热稳定性对酶相对活性的影响 | 第71-72页 |
| 4.5 讨论 | 第72-74页 |
| 第五章 结论 | 第74-76页 |
| 参考文献 | 第76-82页 |
| 致谢 | 第82-84页 |
| 攻读硕士学位期间发表的论文 | 第84页 |
