| 摘要 | 第4-6页 |
| Abstract | 第6-7页 |
| 目录 | 第8-11页 |
| 1 前言 | 第11-26页 |
| 1.1 香蕉枯萎病的概况 | 第11-12页 |
| 1.1.1 香蕉枯萎病的分布及危害 | 第11页 |
| 1.1.2 香蕉枯萎病菌的发病症状 | 第11-12页 |
| 1.2 香蕉枯萎病菌——尖孢镰刀菌古巴专化型 | 第12-16页 |
| 1.2.1 香蕉枯萎病菌的致病机理 | 第13-15页 |
| 1.2.2 香蕉枯萎病菌的致病相关基因研究情况 | 第15-16页 |
| 1.3 根癌农杆菌介导的真菌遗传转化(Agrobacterium Tumefaciens-MediatedTransformation,ATMT) | 第16-20页 |
| 1.3.1 ATMT在丝状真菌上的应用 | 第17-18页 |
| 1.3.2 ATMT的原理 | 第18-19页 |
| 1.3.3 ATMT的特点 | 第19-20页 |
| 1.4 获得T-DNA侧翼序列的研究方法 | 第20-24页 |
| 1.4.1 反向PCR(Inverse-PCR) | 第20-21页 |
| 1.4.2 接头PCR(Linker adaptor PCR) | 第21-22页 |
| 1.4.3 热不对称交错PCR(Thermal Asmmetric Interlaced PCR,TAIL-PCR) | 第22-24页 |
| 1.5 本实验的研究目的与方法 | 第24-26页 |
| 1.5.1 实验研究目的 | 第24页 |
| 1.5.2 实验思路 | 第24-26页 |
| 2 实验方法 | 第26-49页 |
| 2.1 材料 | 第26-29页 |
| 2.1.1 实验材料 | 第26-27页 |
| 2.1.2 培养基及试剂 | 第27-29页 |
| 2.1.3 仪器 | 第29页 |
| 2.1.4 引物 | 第29页 |
| 2.2 ATMT转化方法 | 第29-30页 |
| 2.2.1 农杆菌的培养 | 第29-30页 |
| 2.2.2 FOC4分生孢子的准备 | 第30页 |
| 2.2.3 根癌农杆菌的准备 | 第30页 |
| 2.2.4 根癌农杆菌介导的FOC4转化 | 第30页 |
| 2.2.5 突变体的保存 | 第30页 |
| 2.3 突变体库的分析 | 第30-33页 |
| 2.3.1 转化子的分子检测 | 第30-32页 |
| 2.3.2 转化子的生物学特征 | 第32页 |
| 2.3.3 转化子致病性的测定 | 第32-33页 |
| 2.4 突变体的T-DNA侧翼序列的hiTAIL-PCR扩增及基因的克隆 | 第33-37页 |
| 2.4.1 筛选的转化子基因组DNA的提取 | 第33-34页 |
| 2.4.2 hiTAIL-PCR反应引物设计位置示意图 | 第34页 |
| 2.4.3 hiTAIL-PCR反应程式及体系 | 第34-35页 |
| 2.4.4 hiTAIL-PCR扩增侧翼的序列克隆测序 | 第35-37页 |
| 2.4.5 扩增的侧翼片段的生物信息学分析 | 第37页 |
| 2.5 FOC4菌株中fopel基因的敲除载体的构建 | 第37-43页 |
| 2.5.1 FOC4基因组中fopel基因的扩增鉴定 | 第37-38页 |
| 2.5.2 同源臂的克隆鉴定 | 第38-41页 |
| 2.5.3 fopelB连接至载体pCX62 | 第41-42页 |
| 2.5.4 fopelA连接至载体fopelB-pCX62 | 第42-43页 |
| 2.6 敲除载体的原生质体转化 | 第43-49页 |
| 2.6.1 转化片段的准备 | 第43-44页 |
| 2.6.2 制备原生质体 | 第44页 |
| 2.6.3 原生质体转化 | 第44-45页 |
| 2.6.4 转化子的PCR鉴定 | 第45-46页 |
| 2.6.5 突变体的保存 | 第46页 |
| 2.6.6 突变体的RT-PCR检测 | 第46-47页 |
| 2.6.7 fopel基因缺失突变体△FOC4的生物特性的比较分析 | 第47-48页 |
| 2.6.8 fopel基因缺失转化子△FOC4致病性检测 | 第48-49页 |
| 3 实验结果分析 | 第49-67页 |
| 3.1 香蕉枯萎病菌B_2的T-DNA插入突变体库的构建 | 第49页 |
| 3.2 突变体库的分子分析 | 第49-50页 |
| 3.3 突变体的生物学观察 | 第50-52页 |
| 3.3.1 突变体形态、生长情况的观察统计结果 | 第50-52页 |
| 3.3.2 突变体产孢量的统计结果 | 第52页 |
| 3.4 转化子致病性的测定 | 第52-56页 |
| 3.4.1 离体叶片致病性实验 | 第53页 |
| 3.4.2 活体叶片致病性实验 | 第53-54页 |
| 3.4.3 香蕉离体叶鞘致病性实验 | 第54页 |
| 3.4.4 水培袋装苗致病性实验 | 第54-56页 |
| 3.5 突变体T-DNA侧翼序列的获得 | 第56-59页 |
| 3.5.1 突变体T-DNA侧翼序列的扩增克隆 | 第56-57页 |
| 3.5.2 突变体T-DNA侧翼序列的扩增克隆测序结果分析 | 第57-59页 |
| 3.6 FOC4中fopel基因的敲除 | 第59-61页 |
| 3.6.1 FOC4中fopel基因的克隆及鉴定 | 第59页 |
| 3.6.2 敲除载体同源臂的扩增及鉴定 | 第59页 |
| 3.6.3 fopelB连接至pCX62与同源重组的pCX62质粒鉴定 | 第59-61页 |
| 3.7 原生质体转化fopel-AhphB片段 | 第61-67页 |
| 3.7.1 扩增所需转化片段并转化 | 第61-62页 |
| 3.7.2 转化子的PCR鉴定 | 第62-64页 |
| 3.7.3 fopel基因缺失突变体△FOC4生物学特性的比较分析 | 第64-65页 |
| 3.7.3.1 菌落形态与生长速率的测定 | 第64页 |
| 3.7.3.2 孢子与菌丝形态的观察比较 | 第64-65页 |
| 3.7.4 fopel基因缺失转化子△FOC4致病性检测 | 第65-67页 |
| 4 实验结论与讨论 | 第67-72页 |
| 4.1 实验主要结论 | 第67页 |
| 4.2 农杆菌介导的真菌突变体库的构建 | 第67-69页 |
| 4.3 突变体的筛选工作 | 第69-70页 |
| 4.4 侧翼序列的获得——hiTAIL-PCR | 第70-71页 |
| 4.5 基因的敲除 | 第71-72页 |
| 5 参考文献 | 第72-77页 |
| 附录一 论文用到的引物 | 第77-78页 |
| 附录二 TAIL-PCR扩增的序列测序结果 | 第78-80页 |
| 附录三 fopel基因克隆的测序结果 | 第80-81页 |
| 致谢 | 第81页 |
