| 摘要 | 第6-7页 |
| Abstract | 第7-8页 |
| 图表目录 | 第12-14页 |
| 第一章 序言 | 第14-29页 |
| 1.1 栖热菌及其噬菌体研究 | 第14-16页 |
| 1.1.1 栖热菌及其噬菌体研究进展 | 第14-15页 |
| 1.1.2 栖热菌噬菌体TSP4概述 | 第15-16页 |
| 1.2 嗜热微生物酶的研究 | 第16-18页 |
| 1.2.1 嗜热酶的研究进展 | 第16-17页 |
| 1.2.2 脱氨酶功能简介及其研究意义 | 第17-18页 |
| 1.3 蛋白质的热稳定性 | 第18-26页 |
| 1.3.1 蛋白质热稳定性机制 | 第18-22页 |
| 1.3.2 蛋白质热稳定性研究方法及其优缺点 | 第22-24页 |
| 1.3.3 提高蛋白质热稳定性的策略 | 第24-25页 |
| 1.3.4 蛋白质热稳定性的研究意义 | 第25-26页 |
| 1.4 熵与结构熵 | 第26-29页 |
| 1.4.1 熵与结构熵的概念 | 第26页 |
| 1.4.2 结构熵的计算 | 第26-27页 |
| 1.4.3 结构熵的应用 | 第27-29页 |
| 第二章 栖热菌TSP4 dCTP脱氨酶tspdCTP的克隆表达及酶学特征分析 | 第29-56页 |
| 2.1 材料 | 第29-30页 |
| 2.1.1 菌株和质粒 | 第29页 |
| 2.1.2 培养基和抗生素 | 第29页 |
| 2.1.3 试剂 | 第29-30页 |
| 2.2 方法 | 第30-41页 |
| 2.2.1 TSP4基因组的制备 | 第30-31页 |
| 2.2.1.1 宿主栖热菌的培养 | 第30页 |
| 2.2.1.2 噬菌体TSP4的培养 | 第30页 |
| 2.2.1.3 TSP4噬菌体基因组的提取 | 第30-31页 |
| 2.2.2 引物的设计与合成 | 第31页 |
| 2.2.3 脱氨酶tspdCTP的克隆表达 | 第31-38页 |
| 2.2.3.1 PCR扩增tspdCTP基因 | 第31-32页 |
| 2.2.3.2 PCR产物的胶回收纯化 | 第32页 |
| 2.2.3.3 化学转化法制备E.coli DH5α感受态细胞 | 第32-33页 |
| 2.2.3.4 tspdCTP基因PCR扩增产物的检验 | 第33-34页 |
| 2.2.3.5 质粒双酶切 | 第34页 |
| 2.2.3.6 表达质粒的构建 | 第34-36页 |
| 2.2.3.7 E.coli Rosetta(DE3)感受态细胞的制作 | 第36页 |
| 2.2.3.8 重组质粒转化表达菌株Rosetta(DE3) | 第36页 |
| 2.2.3.9 tspdCTP脱氨酶蛋白的诱导表达 | 第36-38页 |
| 2.2.4 重组tspdCTP脱氨酶的纯化 | 第38-39页 |
| 2.2.5 蛋白含量的测定 | 第39页 |
| 2.2.6 重组dCTP脱氨酶tspdCTP蛋白的酶活的测定 | 第39-40页 |
| 2.2.6.1 tspdCTP蛋白酶活测定原理 | 第39-40页 |
| 2.2.6.2 tspdCTP蛋白酶活测定方法 | 第40页 |
| 2.2.7 tspdCTP脱氨酶酶学性质研究 | 第40-41页 |
| 2.2.7.1 tspdCTP脱氨酶酶最适催化温度 | 第40-41页 |
| 2.2.7.2 tspdCTP脱氨酶酶最适催化pH | 第41页 |
| 2.2.7.3 tspdCTP脱氨酶的底物特异性 | 第41页 |
| 2.2.7.4 金属离子对tspdCTP脱氨酶酶活性的影响 | 第41页 |
| 2.2.7.5 有机溶剂对tspdCTP脱氨酶酶活性的影响 | 第41页 |
| 2.2.8 tspdCTP生物信息学分析 | 第41页 |
| 2.3 结果分析 | 第41-54页 |
| 2.3.1 重组蛋白dCTP脱氨酶的克隆表达结果 | 第41-44页 |
| 2.3.2 重组脱氨酶tspdCTP的诱导表达 | 第44-45页 |
| 2.3.3 重组脱氨酶tspdCTP可溶性表达条件的摸索 | 第45-46页 |
| 2.3.4 重组蛋白tspdCTP纯化条件的摸索 | 第46-47页 |
| 2.3.5 重组蛋白tspdCTP的酶活的测定 | 第47-48页 |
| 2.3.5.1 tspdCTP蛋白含量测定 | 第47页 |
| 2.3.5.2 tspdCTP酶活测定结果 | 第47-48页 |
| 2.3.6 tspdCTP脱氨酶酶学性质研究结果 | 第48-50页 |
| 2.3.6.1 tspdCTP脱氨酶酶的最适催化温度 | 第48页 |
| 2.3.6.2 tspdCTP脱氨酶酶最适催化pH | 第48-49页 |
| 2.3.6.3 tspdCTP脱氨酶的底物特异性 | 第49页 |
| 2.3.6.4 金属离子对dCTP脱氨酶酶活性的影响 | 第49-50页 |
| 2.3.6.5 有机溶剂对tspdCTP脱氨酶酶活性的影响 | 第50页 |
| 2.3.7 tspdCTP生物信息学分析 | 第50-54页 |
| 2.4 结论及讨论 | 第54-56页 |
| 第三章 常温与高温dCTP脱氨酶结构熵的分布特征 | 第56-68页 |
| 3.1 材料及方法 | 第56-59页 |
| 3.1.1 数据库及其使用 | 第56-58页 |
| 3.1.1.1 BLAST序列比对 | 第56-57页 |
| 3.1.1.2 分子进化分析 | 第57-58页 |
| 3.1.1.3 同源建模服务器分析 | 第58页 |
| 3.1.2 分析方法 | 第58-59页 |
| 3.1.2.1 序列相似性分析 | 第58页 |
| 3.1.2.2 系统平均结构熵(E)运算 | 第58-59页 |
| 3.1.2.3 平均结构熵(E4)运算 | 第59页 |
| 3.1.2.4 高低熵值分布 | 第59页 |
| 3.2 结果与分析 | 第59-65页 |
| 3.2.1 高温dCTP脱氨酶与常温dCTP脱氨酶的序列比对 | 第59-60页 |
| 3.2.2 高温dCTP脱氨酶的结构熵分布 | 第60-61页 |
| 3.2.3 保守区域的结构熵分布特征比较 | 第61-63页 |
| 3.2.4 保守区域附近的结构熵分布特征 | 第63-65页 |
| 3.3 结论及讨论 | 第65-68页 |
| 第四章 基于熵值分析的tspdCTP脱氨酶突变 | 第68-102页 |
| 4.1 材料 | 第68页 |
| 4.1.1 菌株和质粒 | 第68页 |
| 4.1.2 培养基 | 第68页 |
| 4.1.3 培养基中抗生素终浓度 | 第68页 |
| 4.2 方法 | 第68-77页 |
| 4.2.1 突变引物设计 | 第68-70页 |
| 4.2.2 PCR扩增tspdCTP脱氨酶突变体基因 | 第70-75页 |
| 4.2.3 重组质粒的构建 | 第75-76页 |
| 4.2.3.1 连接 | 第75页 |
| 4.2.3.2 重组质粒的转化 | 第75页 |
| 4.2.3.3 菌落PCR筛选出阳性菌落 | 第75-76页 |
| 4.2.3.4 阳性克隆增菌 | 第76页 |
| 4.2.3.5 重组质粒抽提 | 第76页 |
| 4.2.3.6 重组质粒的酶切鉴定 | 第76页 |
| 4.2.4 重组质粒转化表达菌株Rosetta(DE3) | 第76-77页 |
| 4.2.5 tspdCTP脱氨酶突变体蛋白的诱导表达 | 第77页 |
| 4.2.6 重组dCTP脱氨酶突变体的纯化 | 第77页 |
| 4.2.7 tspdCTP脱氨酶热稳定性分析 | 第77页 |
| 4.3 结果与分析 | 第77-101页 |
| 4.3.1 tspdCTP脱氨酶突变体基因扩增结果 | 第77-89页 |
| 4.3.2 重组脱氨酶tspdCTP突变体的表达 | 第89-98页 |
| 4.3.3 tspdCTP脱氨酶热稳定性分析结果 | 第98-101页 |
| 4.4 结论及讨论 | 第101-102页 |
| 第五章 总结及展望 | 第102-104页 |
| 5.1 总结 | 第102-103页 |
| 5.2 展望 | 第103-104页 |
| 致谢 | 第104-105页 |
| 参考文献 | 第105-111页 |
| 附录A 培养基及药品配制 | 第111-114页 |
| 附录B 主要仪器及试剂 | 第114-116页 |
| 附录C 攻读硕士期间发表论文目录 | 第116页 |
