| 摘要 | 第3-5页 |
| Abstract | 第5-7页 |
| 常用英文缩略词 | 第8-17页 |
| 第一章 前言 | 第17-27页 |
| 1.1 研究背景 | 第17-25页 |
| 1.1.1 无乳链球菌的研究进展 | 第18-19页 |
| 1.1.2 无乳链球菌的致病性与致病机理研究进展 | 第19-22页 |
| 1.1.2.1 无乳链球菌引起的临床症状 | 第19页 |
| 1.1.2.2 无乳链球菌的传播途径 | 第19页 |
| 1.1.2.3 无乳链球菌的致病机理 | 第19-20页 |
| 1.1.2.4 环境与无乳链球菌致病力的关系 | 第20-21页 |
| 1.1.2.5 密度感应系统与致病力的关系 | 第21-22页 |
| 1.1.3 诊断技术 | 第22页 |
| 1.1.4 防控技术 | 第22-25页 |
| 1.1.4.1 中药免疫增强剂 | 第22-23页 |
| 1.1.4.2 益生菌 | 第23-24页 |
| 1.1.4.3 疫苗 | 第24-25页 |
| 1.2 研究目的及意义 | 第25-26页 |
| 1.3 研究技术路线 | 第26-27页 |
| 第二章 罗非鱼无乳链球菌分离、鉴定 | 第27-45页 |
| 2.1 引言 | 第27页 |
| 2.2 材料和方法 | 第27-36页 |
| 2.2.1 材料 | 第27-29页 |
| 2.2.1.1 试验动物 | 第27页 |
| 2.2.1.2 主要仪器 | 第27-28页 |
| 2.2.1.3 主要试剂 | 第28页 |
| 2.2.1.4 主要培养基的配制 | 第28页 |
| 2.2.1.5 主要试剂的配制 | 第28-29页 |
| 2.2.1.6 引物 | 第29页 |
| 2.2.2 试验方法 | 第29-36页 |
| 2.2.2.1 病样采集 | 第29页 |
| 2.2.2.2 菌株鉴定 | 第29-35页 |
| 2.2.2.3 无乳链球菌与宿主罗非鱼进化关系分析 | 第35-36页 |
| 2.3 结果与分析 | 第36-44页 |
| 2.3.1 病鱼解剖与菌株结果 | 第36页 |
| 2.3.2 生化鉴定结果 | 第36-37页 |
| 2.3.3 分离菌株PCR结果与分析 | 第37-38页 |
| 2.3.4 药敏试验 | 第38-39页 |
| 2.3.5 人工感染动物试验结果 | 第39-40页 |
| 2.3.6 分离菌株分子血清分型结果 | 第40页 |
| 2.3.7 各分离株检测结果总结 | 第40-41页 |
| 2.3.8 无乳链球菌与宿主罗非鱼进化关系 | 第41-44页 |
| 2.4 小结 | 第44-45页 |
| 第三章 罗非鱼源无乳链球菌lux S缺失突变体构建及其活性分析 | 第45-69页 |
| 3.1 引言 | 第45-46页 |
| 3.2 材料与方法 | 第46-59页 |
| 3.2.1 材料 | 第46-50页 |
| 3.2.1.1 菌株、质粒 | 第46页 |
| 3.2.1.2 主要仪器 | 第46页 |
| 3.2.1.3. 供试材料 | 第46页 |
| 3.2.1.4 主要培养基的配制 | 第46-47页 |
| 3.2.1.5 主要试剂的配制 | 第47-48页 |
| 3.2.1.6 试验用引物 | 第48-50页 |
| 3.2.2 方法 | 第50-59页 |
| 3.2.2.1 细菌培养 | 第50页 |
| 3.2.2.2 ZX1细菌基因组提取 | 第50页 |
| 3.2.2.3 Lux S基因扩增 | 第50页 |
| 3.2.2.4 PCR产物的胶回收以及连接T载体 | 第50-51页 |
| 3.2.2.5 基因敲除载体的构建 | 第51-53页 |
| 3.2.2.6 基因敲除突变体的筛选和鉴定 | 第53-54页 |
| 3.2.2.7 基因缺失突变回复株的构建与鉴定 | 第54-55页 |
| 3.2.2.8 细菌生长曲线测定 | 第55页 |
| 3.2.2.9 生物发光试验 | 第55-56页 |
| 3.2.2.10 抗生素抗性试验 | 第56页 |
| 3.2.2.11 毒力试验 | 第56页 |
| 3.2.2.12 基因敲除对毒力因子转录水平影响 | 第56-58页 |
| 3.2.2.13 酸耐受试验 | 第58页 |
| 3.2.2.14 细胞粘附试验 | 第58-59页 |
| 3.3 结果与分析 | 第59-68页 |
| 3.3.1 Lux S基因扩增 | 第59-60页 |
| 3.3.2 敲除载体的构建 | 第60-61页 |
| 3.3.3 无乳链球菌lux S基因缺失突变体和缺失突变回复体的筛选与鉴定 | 第61-62页 |
| 3.3.4 细菌生长曲线测定 | 第62-63页 |
| 3.3.5 生物发光检测 | 第63页 |
| 3.3.6 抗生素抗性试验 | 第63-65页 |
| 3.3.7 毒力试验 | 第65-66页 |
| 3.3.8 酸耐受 | 第66-67页 |
| 3.3.9 细胞粘附 | 第67页 |
| 3.3.10 毒力因子转录水平测定 | 第67-68页 |
| 3.4 小结 | 第68-69页 |
| 第四章 罗非鱼无乳链球菌免疫原性蛋白的筛选 | 第69-84页 |
| 4.1 引言 | 第69-70页 |
| 4.2 材料和方法 | 第70-79页 |
| 4.2.1 材料 | 第70-73页 |
| 4.2.1.1 菌株、质粒及培养条件 | 第70页 |
| 4.2.1.2 主要试剂 | 第70页 |
| 4.2.1.3 主要仪器 | 第70-71页 |
| 4.2.1.4 主要试剂的配制 | 第71页 |
| 4.2.1.5 SDS-PAGE相关试剂配制 | 第71-72页 |
| 4.2.1.6 Western blot相关试剂配制 | 第72页 |
| 4.2.1.7 蛋白表达及纯化相关试剂配制 | 第72-73页 |
| 4.2.1.8 引物 | 第73页 |
| 4.2.2 实验方法 | 第73-79页 |
| 4.2.2.1 无乳链球菌的复苏和基因组的提取 | 第73页 |
| 4.2.2.2 无乳链球菌基因片段的扩增 | 第73-74页 |
| 4.2.2.3 PCR产物及酶切产物的回收和纯化 | 第74页 |
| 4.2.2.4 大肠杆菌感受态细胞的制备（氯化钙法） | 第74-75页 |
| 4.2.2.5 质粒复苏与小量制备 | 第75-76页 |
| 4.2.2.6 重组表达载体的构建 | 第76页 |
| 4.2.2.7 重组蛋白的诱导表达 | 第76页 |
| 4.2.2.8 重组蛋白的纯化 | 第76-77页 |
| 4.2.2.9 蛋白浓度的测定 | 第77-78页 |
| 4.2.2.10 SDS-PAGE蛋白凝胶电泳 | 第78页 |
| 4.2.2.11 鼠多克隆抗体的制备 | 第78页 |
| 4.2.2.12 重组蛋白的Western blot检测 | 第78-79页 |
| 4.3 结果与分析 | 第79-82页 |
| 4.3.1 无乳链球菌免疫原性蛋白重组表达质粒的构建 | 第79-80页 |
| 4.3.1.1 目的基因的扩增及测序 | 第79-80页 |
| 4.3.1.2 重组表达质粒的构建及鉴定 | 第80页 |
| 4.3.2 重组蛋白的诱导表达与纯化 | 第80-81页 |
| 4.3.3 重组蛋白的Western-blot分析 | 第81-82页 |
| 4.4 小结 | 第82-84页 |
| 第五章 罗非鱼Ig M的纯化及其生物素标记多克隆抗体的制备 | 第84-92页 |
| 5.1 引言 | 第84-85页 |
| 5.2 材料与方法 | 第85-87页 |
| 5.2.1 材料 | 第85页 |
| 5.2.1.1 试验动物 | 第85页 |
| 5.2.1.2 主要试剂 | 第85页 |
| 5.2.1.3 主要仪器 | 第85页 |
| 5.2.1.4 主要试剂的配制 | 第85页 |
| 5.2.2 方法 | 第85-87页 |
| 5.2.2.1 罗非鱼血清的采集及纯化 | 第85-86页 |
| 5.2.2.2 兔抗罗非鱼血清Ig M多克隆抗体的制备 | 第86页 |
| 5.2.2.3 兔抗血清效价的测定 | 第86页 |
| 5.2.2.4 兔抗罗非鱼Ig M多克隆抗体的纯化及其生物素标记 | 第86页 |
| 5.2.2.5 ELISA测定抗体滴度 | 第86-87页 |
| 5.2.2.6 兔抗血清的Western-blot检测 | 第87页 |
| 5.3 结果与分析 | 第87-90页 |
| 5.3.1 罗非鱼血清Ig M纯化及检测结果 | 第87-88页 |
| 5.3.2 兔抗罗非鱼Ig M血清效价及其生物素标记多克隆抗体滴度的测定 | 第88-89页 |
| 5.3.3 兔抗罗非鱼Ig M血清的Western blot检测结果 | 第89-90页 |
| 5.4 小结 | 第90-92页 |
| 第六章 罗非鱼无乳链球菌真核表达质粒的构建 | 第92-103页 |
| 6.1 引言 | 第92-93页 |
| 6.2 材料与方法 | 第93-98页 |
| 6.2.1 材料 | 第93-94页 |
| 6.2.1.1 菌株、质粒及培养条件 | 第93页 |
| 6.2.1.2 主要试剂 | 第93页 |
| 6.2.1.3 主要仪器 | 第93页 |
| 6.2.1.4 主要试剂的配制 | 第93页 |
| 6.2.1.5 引物 | 第93-94页 |
| 6.2.2 实验方法 | 第94-98页 |
| 6.2.2.1 无乳链球菌的复苏和基因组提取 | 第94页 |
| 6.2.2.2 无乳链球菌基因片段的扩增 | 第94-95页 |
| 6.2.2.3 PCR产物的回收和纯化 | 第95页 |
| 6.2.2.4 pc DNA3.1 质粒的复苏和提取 | 第95-96页 |
| 6.2.2.5 pc DNA3.1 质粒的转化 | 第96页 |
| 6.2.2.6 大肠杆菌感受态细胞的制备 | 第96-97页 |
| 6.2.2.7 重组表达载体的构建 | 第97-98页 |
| 6.3 结果与分析 | 第98-101页 |
| 6.3.1 pc DNA-sip重组载体构建结果 | 第98-99页 |
| 6.3.2 pc DNA-cps E重组载体构建结果 | 第99-100页 |
| 6.3.3 pc DNA-sip-cps E重组载体构建结果 | 第100页 |
| 6.3.4 pc DNA-IL8-sip-cps E重组载体构建结果 | 第100-101页 |
| 6.3.5 pc DNA-sip-IL8-cps E重组载体构建结果 | 第101页 |
| 6.4 小结 | 第101-103页 |
| 第七章 壳聚糖-PLGA包裹无乳链球菌口服疫苗及其免疫研究 | 第103-117页 |
| 7.1 引言 | 第103页 |
| 7.2 材料与方法 | 第103-109页 |
| 7.2.1 试验材料 | 第103-104页 |
| 7.2.1.1 菌株、质粒及培养条件 | 第103页 |
| 7.2.1.2 主要试剂 | 第103页 |
| 7.2.1.3 主要仪器 | 第103-104页 |
| 7.2.1.4 主要试剂的配制 | 第104页 |
| 7.2.1.5 本章所用引物 | 第104页 |
| 7.2.2 方法 | 第104-109页 |
| 7.2.2.1 壳聚糖吸附PLGA包裹核酸疫苗的制备以及最佳工艺条件测定 | 第104-105页 |
| 7.2.2.2 口服疫苗的安全性测定 | 第105页 |
| 7.2.2.3 免疫罗非鱼 | 第105-106页 |
| 7.2.2.4 免疫效价的测定 | 第106页 |
| 7.2.2.5 微囊核酸疫苗在鱼体组织中的表达 | 第106-108页 |
| 7.2.2.6 免疫保护率测定 | 第108-109页 |
| 7.3 结果与分析 | 第109-115页 |
| 7.3.1 壳聚糖吸附PLGA包裹核酸疫苗的制备以及最佳工艺条件 | 第109-110页 |
| 7.3.2 口服疫苗的安全性 | 第110页 |
| 7.3.3 ELISA效价测定 | 第110-113页 |
| 7.3.3.1 pc DNA-sip口服核酸疫苗组ELISA效价结果 | 第110-111页 |
| 7.3.3.2 pc DNA-cps E口服核酸疫苗组ELISA效价结果 | 第111页 |
| 7.3.3.3 pc DNA-sip-cps E口服核酸疫苗组ELISA效价结果 | 第111-112页 |
| 7.3.3.4 pc DNA-IL8-sip-cps E口服核酸疫苗组ELISA效价结果 | 第112-113页 |
| 7.3.3.5 pc DNA-sip-IL8-cps E口服核酸疫苗组ELISA效价结果 | 第113页 |
| 7.3.4 免疫保护率测定 | 第113-115页 |
| 7.3.4.1 注射核酸疫苗组相对免疫保护率测定 | 第113-114页 |
| 7.3.4.2 口服核酸疫苗组相对免疫保护率测定 | 第114-115页 |
| 7.3.5 转录水平测定 | 第115页 |
| 7.4 小结 | 第115-117页 |
| 第八章 全文讨论与结论 | 第117-123页 |
| 8.1 全文讨论 | 第117-121页 |
| 8.1.1 无乳链球菌分离、鉴定与流行病学分析 | 第117页 |
| 8.1.2 无乳链球菌密度感应系统与致病力关系 | 第117-118页 |
| 8.1.3 兔抗罗非鱼Ig M多克隆抗体的制备与应用 | 第118-119页 |
| 8.1.4 无乳链球菌免疫原性蛋白的筛选 | 第119-120页 |
| 8.1.5 壳聚糖-PLGA载无乳链球菌口服核酸疫苗的研究 | 第120-121页 |
| 8.1.6 下一步研究展望 | 第121页 |
| 8.2 全文结论 | 第121-122页 |
| 8.3 全文创新点 | 第122-123页 |
| 参考文献 | 第123-136页 |
| 致谢 | 第136-137页 |
| 附录 | 第137页 |
