| 摘要 | 第4-6页 |
| ABSTRACT | 第6-7页 |
| 第一章 前言 | 第11-23页 |
| 1.1 肽酶的概述 | 第11-12页 |
| 1.2 丝氨酸蛋白酶家族 | 第12-13页 |
| 1.2.1 丝氨酸蛋白酶的空间结构及催化中心三联体结构 | 第12-13页 |
| 1.2.2 丝氨酸蛋白酶的催化机制 | 第13页 |
| 1.3 丝氨酸蛋白酶家族重要成员及的应用 | 第13-15页 |
| 1.3.1 胰蛋白酶 | 第13-14页 |
| 1.3.2 枯草杆菌蛋白酶 | 第14页 |
| 1.3.3 丝氨酸羧肽酶 | 第14-15页 |
| 1.3.4 胰凝乳蛋白酶 | 第15页 |
| 1.4 肽酶的研究现状 | 第15页 |
| 1.5 易错PCR技术的概述 | 第15-17页 |
| 1.5.1 易错PCR技术的概念 | 第16页 |
| 1.5.2 易错PCR技术的原理 | 第16-17页 |
| 1.5.3 易错PCR技术的发展 | 第17页 |
| 1.6 易错PCR技术的应用 | 第17-21页 |
| 1.6.1 提高酶的催活力 | 第17-18页 |
| 1.6.2 提高酶热稳定性 | 第18页 |
| 1.6.3 提高酶的低温适应性 | 第18-19页 |
| 1.6.4 改变酶的pH特性 | 第19页 |
| 1.6.5 改变酶在溶剂中的溶解性 | 第19-20页 |
| 1.6.6 提高菌株对有机溶剂的耐受性 | 第20-21页 |
| 1.6.7 在探究生理机制方面的应用 | 第21页 |
| 1.7 课题的目的与意义 | 第21页 |
| 1.8 研究技术路线 | 第21-23页 |
| 第二章 材料与方法 | 第23-42页 |
| 2.1 实验材料 | 第23-28页 |
| 2.1.1 基因来源 | 第23页 |
| 2.1.2 菌株与质粒 | 第23-24页 |
| 2.1.3 常用药品及酶制剂 | 第24-25页 |
| 2.1.4 溶液与培养基 | 第25-28页 |
| 2.1.5 抗生素 | 第28页 |
| 2.2 菌株的活化与培养 | 第28页 |
| 2.3 质粒的提取 | 第28页 |
| 2.4 DNA纯化及回收 | 第28页 |
| 2.5 感受态细胞的制备 | 第28-29页 |
| 2.6 DNA的转化 | 第29-30页 |
| 2.7 易错PCR条件的优化 | 第30-31页 |
| 2.7.1 Mg~(2+)浓度的确定 | 第30页 |
| 2.7.2 Mn~(2+)浓度的确定 | 第30-31页 |
| 2.7.3 Mg~(2+)和Mn~(2+)的最佳组合 | 第31页 |
| 2.7.4 PCR条件的评价 | 第31页 |
| 2.8 易错PCR突变体库的构建与筛选 | 第31-34页 |
| 2.8.1 易错PCR反应模板的制备 | 第31-32页 |
| 2.8.2 利用易错PCR技术对try1A基因进行扩增 | 第32-33页 |
| 2.8.3 酶切连接 | 第33页 |
| 2.8.4 阳性克隆的筛选 | 第33-34页 |
| 2.8.5 阳性克隆的验证 | 第34页 |
| 2.9 trylA突变基因在大肠杆菌的表达及纯化 | 第34-37页 |
| 2.9.1 突变基因表达载体的构建与转化 | 第34-35页 |
| 2.9.2 目的蛋白的诱导表达 | 第35页 |
| 2.9.3 目的蛋白的纯化 | 第35-37页 |
| 2.10 酶学性质的测定 | 第37-42页 |
| 2.10.1 蛋白酶酶活测定的方法 | 第37-41页 |
| 2.10.2 最适反应温度 | 第41页 |
| 2.10.3 最适反应pH | 第41页 |
| 2.10.4 温度对酶活力的影响 | 第41页 |
| 2.10.5 金属离子对酶活力的影响 | 第41页 |
| 2.10.6 有机试剂对酶活力的影响 | 第41-42页 |
| 第三章 易错PCR条件的优化 | 第42-46页 |
| 3.1 Mg~(2+)浓度的确定 | 第42-43页 |
| 3.2 Mn~(2+)浓度的确定 | 第43页 |
| 3.3 Mg~(2+)和Mn~(2+)最佳组合浓度的确定 | 第43-45页 |
| 3.4 本章小结 | 第45-46页 |
| 第四章 突变体库的构建 | 第46-52页 |
| 4.1 重组质粒的构建 | 第46-47页 |
| 4.1.1 质粒的提取 | 第46-47页 |
| 4.1.2 try1A基因易错PCR扩增 | 第47页 |
| 4.1.3 重组质粒的构建 | 第47页 |
| 4.2 突变体的构建 | 第47-50页 |
| 4.2.1 重组质粒的验证 | 第47-49页 |
| 4.2.2 筛选条件的确定 | 第49-50页 |
| 4.3 阳性克隆的筛选与复筛 | 第50-51页 |
| 4.4 本章小结 | 第51-52页 |
| 第五章 try1A突变基因在大肠杆菌中的表达 | 第52-58页 |
| 5.1 try1A突变基因的表达系统的构建 | 第52-53页 |
| 5.1.1 try1A突变基因的扩增 | 第52-53页 |
| 5.1.2 try1A突变基因重组表达质粒的构建 | 第53页 |
| 5.2 try1A突变基因在大肠杆菌中的表达纯化 | 第53-57页 |
| 5.3 本章小结 | 第57-58页 |
| 第六章 Try1A突变酶酶学性质的研究 | 第58-69页 |
| 6.1 引言 | 第58页 |
| 6.2 突变酶酶学性质的鉴定 | 第58-65页 |
| 6.2.1 最适温度的测定 | 第58-60页 |
| 6.2.2 最适pH的测定 | 第60-61页 |
| 6.2.3 不同温度对蛋白耐受性影响 | 第61-63页 |
| 6.2.4 金属离子对酶活力的影响 | 第63-64页 |
| 6.2.5 化学制剂对酶活力的影响 | 第64-65页 |
| 6.3 酶动力学参数的测定 | 第65-68页 |
| 6.4 本章小结 | 第68-69页 |
| 第七章 讨论和展望 | 第69-76页 |
| 7.1 讨论 | 第69-74页 |
| 7.1.1 易错PCR条件的优化 | 第69-70页 |
| 7.1.2 突变体库的筛选 | 第70-71页 |
| 7.1.3 蛋白的表达纯化 | 第71-72页 |
| 7.1.4 突变酶与原始酶酶学性质分析 | 第72-74页 |
| 7.2 展望 | 第74-76页 |
| 参考文献 | 第76-83页 |
| 附录 | 第83-85页 |
| 致谢 | 第85-86页 |
| 攻读研究生学位期间的科研成果 | 第86页 |
