| 摘要 | 第10-13页 |
| Abstract | 第13-15页 |
| 第1章 引言 | 第19-36页 |
| 1.1 弧菌分布及生物学性质 | 第19页 |
| 1.2 细菌活的非可培养（VBNC） | 第19-25页 |
| 1.2.1 VBNC的形成及特征 | 第19-20页 |
| 1.2.2 细胞进入VBNC状态的诱导因子 | 第20-21页 |
| 1.2.3 VBNC细胞的致病力 | 第21页 |
| 1.2.4 VBNC细胞的检测方法 | 第21-23页 |
| 1.2.5 VBNC细胞的复苏方法 | 第23-25页 |
| 1.3 复苏促进因子Rpf/YeaZ的发现及蛋白家族基因组成 | 第25-26页 |
| 1.4 细胞复苏促进因子蛋白家族的生物学活性 | 第26-29页 |
| 1.5 细胞复苏促进因子在自然环境中的应用 | 第29-31页 |
| 1.6 土壤微生物多样性 | 第31-34页 |
| 1.6.1 土壤微生物在自然环境中的作用 | 第31-32页 |
| 1.6.2 土壤微生物的研究方法 | 第32-33页 |
| 1.6.3 影响土壤微生物多样性的因素 | 第33页 |
| 1.6.4 土壤微生物多样性研究展望 | 第33-34页 |
| 1.7 本课题研究意义及目的 | 第34-35页 |
| 1.8 本课题研究技术路线 | 第35-36页 |
| 第2章 弧菌复苏促进因子YeaZ基因克隆与原核表达 | 第36-57页 |
| 2.1 前言 | 第36页 |
| 2.2 实验材料与仪器 | 第36-40页 |
| 2.2.1 菌株与质粒 | 第36-38页 |
| 2.2.2 实验试剂与设备 | 第38-40页 |
| 2.3 不同弧菌yeaZ基因的检测 | 第40-42页 |
| 2.3.1 不同弧菌基因组DNA的提取 | 第41页 |
| 2.3.2 采用PCR的方式检测弧菌yeaZ基因 | 第41-42页 |
| 2.4 哈维弧菌与溶藻胶弧菌yeaZ基因的原核表达 | 第42-48页 |
| 2.4.1 yeaZ基因克隆质粒的构建及鉴定 | 第42-44页 |
| 2.4.2 yeaZ基因表达质粒的构建及鉴定 | 第44-45页 |
| 2.4.3 yeaZ基因在大肠杆菌BL21表达 | 第45-47页 |
| 2.4.4 Ni琼脂糖亲和层析柱纯化表达的YeaZ蛋白 | 第47-48页 |
| 2.5 Bradford法测定纯化蛋白浓度 | 第48-49页 |
| 2.6 Western-Blotting检测哈维弧菌yeaZ基因的表达 | 第49页 |
| 2.7 YeaZ对VBNC状态哈维弧菌的复苏作用 | 第49-50页 |
| 2.7.1 哈维弧菌的非可培养 | 第49页 |
| 2.7.2 VBNC状态哈维弧菌的复苏 | 第49-50页 |
| 2.8 结果与分析 | 第50-55页 |
| 2.8.1 不同弧菌yeaZ基因的检测 | 第50页 |
| 2.8.2 哈维弧菌与溶藻胶弧菌yeaZ基因的克隆分析 | 第50-52页 |
| 2.8.3 哈维弧菌与溶藻胶弧菌yeaZ基因的表达分析 | 第52页 |
| 2.8.4 哈维弧菌与溶藻胶弧菌YeaZ的纯化 | 第52-53页 |
| 2.8.5 Westernblotting检测纯化的哈维弧菌YeaZ | 第53页 |
| 2.8.6 哈维弧菌YeaZ对VBNC细胞的复苏促进作用 | 第53-55页 |
| 2.9 讨论 | 第55-57页 |
| 第3章 YeaZ溶菌酶活性及活性位点的PCR定点突变分析 | 第57-70页 |
| 3.1 前言 | 第57-58页 |
| 3.2 实验材料与仪器 | 第58页 |
| 3.3 YeaZ溶菌酶性质的研究 | 第58-61页 |
| 3.3.1 实验原理 | 第58-59页 |
| 3.3.2 试剂的配制 | 第59页 |
| 3.3.3 4-methylumbellifery标准曲线的绘制 | 第59-60页 |
| 3.3.4 YeaZ溶菌酶活力测定 | 第60-61页 |
| 3.3.5 温度对YeaZ溶菌酶稳定性的影响 | 第61页 |
| 3.3.6 pH对YeaZ溶菌酶稳定性的影响 | 第61页 |
| 3.3.7 金属离子和化学试剂对YeaZ溶菌酶活性影响 | 第61页 |
| 3.4 PCR定点突变研究YeaZ溶菌酶的活性位点 | 第61-65页 |
| 3.4.1 突变点的选择 | 第62-63页 |
| 3.4.2 突变引物的设计 | 第63页 |
| 3.4.3 以pUcm-T-yeaZ质粒为模板进行定点突变 | 第63-65页 |
| 3.4.4 突变克隆质粒的鉴定 | 第65页 |
| 3.4.5 突变表达质粒的构建及鉴定 | 第65页 |
| 3.4.6 突变的yeaZ基因表达及纯化 | 第65页 |
| 3.4.7 突变YeaZ蛋白Western-blotting检测 | 第65页 |
| 3.4.8 突变YeaZ蛋白溶菌酶活性测定 | 第65页 |
| 3.5 结果与分析 | 第65-69页 |
| 3.5.1 YeaZ溶菌酶活力 | 第65-66页 |
| 3.5.2 温度及pH对YeaZ溶菌酶活力的影响 | 第66页 |
| 3.5.3 金属离子和部分化学试剂对YeaZ溶菌酶活力影响 | 第66-67页 |
| 3.5.4 定点突变及突变重组YeaZ蛋白的表达纯化 | 第67-68页 |
| 3.5.5 Western-blotting分析突变YeaZ蛋白 | 第68页 |
| 3.5.6 YeaZ活性位点氨基酸突变对蛋白溶菌酶活性影响 | 第68-69页 |
| 3.6 讨论 | 第69-70页 |
| 第4章 YeaZ蛋白酶活性及活性位点的PCR定点突变分析 | 第70-79页 |
| 4.1 前言 | 第70页 |
| 4.2 实验试剂与设备 | 第70-71页 |
| 4.3 YeaZ的蛋白酶活性研究 | 第71-73页 |
| 4.3.1 实验原理 | 第71页 |
| 4.3.2 YeaZ的偶氮酪蛋白水解活性 | 第71-72页 |
| 4.3.3 YeaZ的蛋白酰胺酶活性 | 第72页 |
| 4.3.4 YeaZ的蛋白酯酶活性 | 第72页 |
| 4.3.5 YeaZ对牛血清白蛋白水解活性 | 第72-73页 |
| 4.4 PCR定点突变研究YeaZ的蛋白酶活性位点 | 第73-74页 |
| 4.4.1 突变点选择 | 第73-74页 |
| 4.4.2 突变引物设计 | 第74页 |
| 4.4.3 YeaZ蛋白酶活性位点的定点突变 | 第74页 |
| 4.4.4 突变YeaZ蛋白酶活性测定 | 第74页 |
| 4.5 结果与分析 | 第74-78页 |
| 4.5.1 YeaZ的蛋白酶活性 | 第74-75页 |
| 4.5.2 YeaZ对牛血清白蛋白水解活性 | 第75页 |
| 4.5.3 YeaZ的定点突变及突变蛋白表达纯化 | 第75-76页 |
| 4.5.4 YeaZ活性位点氨基酸突变对蛋白酶活性影响 | 第76-78页 |
| 4.6 讨论 | 第78-79页 |
| 第5章 复苏促进因子YeaZ对新疆火焰山与甘肃民勤盐碱地土壤可培养细菌的影响 | 第79-95页 |
| 5.1 前言 | 第79-80页 |
| 5.2 实验材料与设备 | 第80-81页 |
| 5.2.1 主要试剂与仪器 | 第80页 |
| 5.2.2 采样点概况 | 第80-81页 |
| 5.2.3 培养基和试验菌株 | 第81页 |
| 5.3 实验方法 | 第81-85页 |
| 5.3.1 YeaZ的制备 | 第81页 |
| 5.3.2 土壤水分和pH测定 | 第81页 |
| 5.3.3 土壤可培养细菌的数量测定 | 第81页 |
| 5.3.4 不同形态菌株的分离与保藏 | 第81-82页 |
| 5.3.5 系统发育树分析分离细菌多样性 | 第82页 |
| 5.3.6 DGGE指纹图谱分析土壤细菌多样性 | 第82-85页 |
| 5.4 结果与分析 | 第85-92页 |
| 5.4.1 研究地点的理化因素 | 第85页 |
| 5.4.2 YeaZ蛋白对土壤可培养细菌数量的影响 | 第85-86页 |
| 5.4.3 YeaZ蛋白对土壤可培养细菌多样性的影响 | 第86-91页 |
| 5.4.4 DGGE图谱分析YeaZ对土壤细菌多样性的影响 | 第91-92页 |
| 5.5 讨论 | 第92-95页 |
| 第6章 白银地区半干旱荒漠草原土壤可培养微生物多样性 | 第95-116页 |
| 6.1 前言 | 第95-96页 |
| 6.2 实验材料与设备 | 第96-97页 |
| 6.2.1 主要试剂与仪器 | 第96页 |
| 6.2.2 试验区概况 | 第96-97页 |
| 6.2.3 土壤样品采集与处理 | 第97页 |
| 6.3 实验方法 | 第97-99页 |
| 6.3.1 土壤理化性质的测定 | 第97-99页 |
| 6.3.2 可培养细菌数量测定 | 第99页 |
| 6.3.3 可培养细菌的分离培养及鉴定 | 第99页 |
| 6.4 结果与分析 | 第99-113页 |
| 6.4.1 荒漠草原土壤理化性质 | 第99-102页 |
| 6.4.2 荒漠草原土壤可培养细菌数量的季节差异性 | 第102-103页 |
| 6.4.3 荒漠草原土壤可培养细菌群落的季节差异性 | 第103-109页 |
| 6.4.4 荒漠草原土壤可培养放线菌和真菌群落的多样性 | 第109-110页 |
| 6.4.5 荒漠草原土壤微生物的层化比率 | 第110-111页 |
| 6.4.6 荒漠草原土壤可培养细菌数量与理化因子相关性分析 | 第111-113页 |
| 6.5 讨论 | 第113-116页 |
| 第7章 结论 | 第116-118页 |
| 参考文献 | 第118-137页 |
| 致谢 | 第137-138页 |
| 附录A 攻读学位期间所发表的学术论文目录 | 第138-140页 |
| 附录B 试验所用试剂配制 | 第140-141页 |
