| 摘要 | 第7-9页 |
| Abstract | 第9-11页 |
| 第1章 文献综述 | 第12-28页 |
| 1.1 柑橘无核育种概述 | 第12-14页 |
| 1.1.1 柑橘无核育种的方式 | 第12-14页 |
| 1.2 miRNA研究进展 | 第14-19页 |
| 1.2.1 miRNA的概述 | 第14-15页 |
| 1.2.2 植物miRNA的生物合成 | 第15-16页 |
| 1.2.3 植物miRNA的特点和作用机制 | 第16-18页 |
| 1.2.4 植物miRNA的功能研究 | 第18-19页 |
| 1.3 miR167及其靶基因的调控作用 | 第19-20页 |
| 1.4 CRISPR/Cas9系统的研究进展 | 第20-28页 |
| 1.4.1 基因组编辑技术概述 | 第20-21页 |
| 1.4.2 CRISPR/Cas系统概述 | 第21-22页 |
| 1.4.3 CRISPR/Cas系统的作用机制 | 第22-24页 |
| 1.4.4 CRISPR/Cas9的应用 | 第24-28页 |
| 第2章 引言 | 第28-30页 |
| 第3章 gRNA的设计 | 第30-44页 |
| 3.1 材料与试剂 | 第30页 |
| 3.1.1 材料 | 第30页 |
| 3.1.2 试剂 | 第30页 |
| 3.2 柑橘和番茄中miR167a基因的扩增与序列分析 | 第30-32页 |
| 3.2.1 CTAB法提取植物基因组DNA | 第30-31页 |
| 3.2.2 引物设计及扩增 | 第31-32页 |
| 3.3 设计gRNA位点 | 第32页 |
| 3.4 gRNA体外检测与筛选 | 第32-35页 |
| 3.4.1 体外转录gRNA | 第33-34页 |
| 3.4.2 扩增目标基因的基因组DNA片段 | 第34页 |
| 3.4.3 体外酶切反应 | 第34-35页 |
| 3.5 结果与分析 | 第35-44页 |
| 3.5.1 miR167a序列搜索、比对分析 | 第35-42页 |
| 3.5.2 gRNA位点设计 | 第42-44页 |
| 第4章 pKSE401重组载体构建及遗传转化 | 第44-56页 |
| 4.1 材料与试剂 | 第44-46页 |
| 4.1.1 实验材料 | 第44页 |
| 4.1.2 主要试剂 | 第44-46页 |
| 4.1.3 主要仪器 | 第46页 |
| 4.2 pKSE401重组载体构建 | 第46-50页 |
| 4.2.1 质粒提取 | 第47-48页 |
| 4.2.2 双链DNA的合成 | 第48页 |
| 4.2.3 酶切-连接反应 | 第48页 |
| 4.2.4 转化大肠杆菌并检测 | 第48-50页 |
| 4.2.5 提取质粒并转化农杆菌 | 第50页 |
| 4.3 番茄的遗传转化 | 第50-52页 |
| 4.3.1 番茄种子无菌处理和播种 | 第50-51页 |
| 4.3.2 农杆菌菌液准备 | 第51页 |
| 4.3.3 农杆菌浸染及培养 | 第51-52页 |
| 4.4 结果与分析 | 第52-56页 |
| 4.4.1 pKSE401重组载体构建结果 | 第52-53页 |
| 4.4.2 转基因材料检测鉴定 | 第53-56页 |
| 第5章 pP1C.1C重组载体构建及遗传转化 | 第56-80页 |
| 5.1 材料、仪器与试剂 | 第56-57页 |
| 5.1.1 实验材料 | 第56页 |
| 5.1.2 主要试剂 | 第56-57页 |
| 5.1.3 主要仪器 | 第57页 |
| 5.2 pP1C.5 重组载体构建 | 第57-61页 |
| 5.2.1 BbsⅠ酶切pP1C.5 载体 | 第59页 |
| 5.2.2 纯化回收pP1C.5 载体酶切产物 | 第59页 |
| 5.2.3 制备gRNA靶标位点双链DNA | 第59页 |
| 5.2.4 双链DNA连接到pP1C.5 载体 | 第59-60页 |
| 5.2.5 连接产物转化大肠杆菌感受态细胞 | 第60页 |
| 5.2.6 单克隆菌液PCR检测 | 第60-61页 |
| 5.3 pP1C.1C重组载体构建 | 第61-65页 |
| 5.3.1 pP1C.1 载体插入CFP基因位点 | 第62-63页 |
| 5.3.2 pP1C.5 重组质粒提取 | 第63页 |
| 5.3.3 pP1C.1C质粒提取 | 第63页 |
| 5.3.4 pP1C.5 重组载体和pP1C.1C载体分别双酶切 | 第63-64页 |
| 5.3.5 纯化回收酶切后的片段 | 第64页 |
| 5.3.6 连接并转化大肠杆菌 | 第64-65页 |
| 5.3.7 pP1C.1C重组载体转化农杆菌感受态细胞 | 第65页 |
| 5.4 番茄遗传转化 | 第65-66页 |
| 5.5 柑橘遗传转化 | 第66页 |
| 5.5.1 柑橘种子播种 | 第66页 |
| 5.5.2 菌液准备 | 第66页 |
| 5.5.3 农杆菌浸染及培养 | 第66页 |
| 5.6 转基因植株的检测 | 第66-67页 |
| 5.6.1 转基因材料的荧光检测 | 第66页 |
| 5.6.2 CTAB法提取转基因材料的基因组DNA | 第66-67页 |
| 5.6.3 PCR检测以及测序 | 第67页 |
| 5.7 结果与分析 | 第67-80页 |
| 5.7.1 pP1C.1C重组载体构建结果 | 第67-70页 |
| 5.7.2 番茄遗传转化中转基因材料的获得 | 第70页 |
| 5.7.3 番茄转基因材料检测鉴定 | 第70-77页 |
| 5.7.4 柑橘遗传转化结果 | 第77-80页 |
| 第6章 讨论与结论 | 第80-84页 |
| 6.1 讨论 | 第80-83页 |
| 6.2 结论 | 第83-84页 |
| 参考文献 | 第84-96页 |
| 附录 | 第96-98页 |
| 致谢 | 第98-100页 |
| 发表论文及参与科研项目 | 第100页 |
