| 摘要 | 第3-4页 |
| Abstract | 第4-5页 |
| 第一章 绪论 | 第9-18页 |
| 1.1 酸性脲酶概述 | 第9页 |
| 1.2 酸性脲酶蛋白结构 | 第9-11页 |
| 1.3 脲酶的基因结构 | 第11-13页 |
| 1.4 尿素降解酶的底物类别 | 第13-14页 |
| 1.5 氨基甲酸乙酯 | 第14-16页 |
| 1.6 立题意义 | 第16-17页 |
| 1.7 本论文研究内容 | 第17-18页 |
| 第二章 材料方法 | 第18-27页 |
| 2.1 材料 | 第18-20页 |
| 2.1.1 菌种与质粒 | 第18页 |
| 2.1.2 主要试剂 | 第18页 |
| 2.1.3 主要仪器 | 第18-19页 |
| 2.1.4 培养基与溶液 | 第19-20页 |
| 2.2 方法 | 第20-27页 |
| 2.2.1 野生酸性脲酶的分离纯化 | 第20页 |
| 2.2.2 交联脲酶聚集体的制备 | 第20页 |
| 2.2.3 交联蛋白量的测定 | 第20页 |
| 2.2.4 交联脲酶聚集体的储存稳定性 | 第20-21页 |
| 2.2.5 脲酶结构基因ure ABC的克隆 | 第21页 |
| 2.2.6 基因ureABC与pET-28a载体双酶切与连接 | 第21页 |
| 2.2.7 连接产物转化感受态 | 第21-22页 |
| 2.2.8 重组质粒pET-28a-ureABC的验证 | 第22页 |
| 2.2.9 表达菌株BL21/ureABC的制备 | 第22页 |
| 2.2.10 UreABC的克隆表达及SDS-PAGE验证 | 第22页 |
| 2.2.11 脲酶及EC降解酶酶活的测定 | 第22-23页 |
| 2.2.12 重组BL21/ureABC培养条件的初步优化 | 第23页 |
| 2.2.13 重组脲酶脱辅基蛋白的纯化 | 第23页 |
| 2.2.14 重组脲酶脱辅基蛋白酶学性质初步研究 | 第23页 |
| 2.2.15 脲酶UreC三维结构模拟及分析 | 第23页 |
| 2.2.16 重组脲酶脱辅基蛋白在模拟酒中的应用 | 第23-24页 |
| 2.2.17 PCR扩增辅助基因ureEFGD | 第24页 |
| 2.2.18 PCR产物的纯化及回收 | 第24页 |
| 2.2.19 脲酶辅助基因ureEFGD与pET-28a载体的双酶切 | 第24页 |
| 2.2.20 脲酶辅助基因ureEFGD与pET-28a载体的连接与转化 | 第24页 |
| 2.2.21 重组质粒pET-28a-ureEFGD的验证 | 第24-25页 |
| 2.2.22 重组质粒pET-28a-ureABC-EFGD的构建 | 第25页 |
| 2.2.23 表达菌株BL21/ureABC-EFGD的制备 | 第25页 |
| 2.2.24 重组酸性脲酶的诱导表达及验证 | 第25-26页 |
| 2.2.25 重组脲酶包涵体的复性 | 第26页 |
| 2.2.26 重组脲酶包涵体的纯化 | 第26页 |
| 2.2.27 响应面法优化重组脲酶培养条件 | 第26页 |
| 2.2.28 重组酸性脲酶二级结构分析 | 第26页 |
| 2.2.29 复性蛋白MALDI-TOF/TOF-MS/MS分析 | 第26-27页 |
| 第三章 结果与讨论 | 第27-49页 |
| 3.1 野生酸性脲酶的分离纯化 | 第27-29页 |
| 3.1.1 乙醇分级沉淀纯化 | 第27页 |
| 3.1.2 离子交换层析 | 第27-28页 |
| 3.1.3 SDS-PAGE分析及分离纯化结果 | 第28页 |
| 3.1.4 交联条件对蛋白交联量的影响 | 第28-29页 |
| 3.1.5 交联脲酶聚集体的储存稳定性 | 第29页 |
| 3.2 脲酶结构基因ureABC的克隆及表达 | 第29-40页 |
| 3.2.1 结构基因ureABC的克隆 | 第29-30页 |
| 3.2.2 UreABC表达菌株的构建 | 第30-31页 |
| 3.2.3 脲酶脱辅基蛋白在大肠杆菌中的表达 | 第31-32页 |
| 3.2.4 Ni~(2+)对脲酶脱辅基蛋白的激活作用 | 第32页 |
| 3.2.5 诱导温度对脲酶脱辅基蛋白产酶量的影响 | 第32-34页 |
| 3.2.6 IPTG对脲酶脱辅基蛋白产酶量的影响 | 第34页 |
| 3.2.7 诱导时间对脲酶脱辅基蛋白产酶量的影响 | 第34-35页 |
| 3.2.8 重组脲酶脱辅基蛋白的纯化 | 第35-36页 |
| 3.2.9 脲酶脱辅基蛋白分子量的测定 | 第36页 |
| 3.2.10 脲酶脱辅基蛋白的pH稳定性及乙醇耐受性 | 第36-37页 |
| 3.2.11 UreC结构模拟及分析 | 第37-39页 |
| 3.2.12 重组脲酶脱辅基蛋白应用效果 | 第39-40页 |
| 3.3 酸性脲酶结构基因与辅助基因共表达 | 第40-49页 |
| 3.3.1 共表达载体的构建 | 第40-41页 |
| 3.3.2 重组脲酶在大肠杆菌中的表达 | 第41页 |
| 3.3.3 脲酶二级结构预测及二硫键分析 | 第41-42页 |
| 3.3.4 包涵体复性液中谷胱甘肽的优化 | 第42页 |
| 3.3.5 响应面设计结果与方差分析 | 第42-45页 |
| 3.3.6 响应面实验结果的验证 | 第45-46页 |
| 3.3.7 重组脲酶的纯化 | 第46页 |
| 3.3.8 重组酸性脲酶二级结构分析 | 第46-47页 |
| 3.3.9 UreC质谱分析 | 第47-49页 |
| 主要结论与展望 | 第49-50页 |
| 主要结论 | 第49页 |
| 展望 | 第49-50页 |
| 致谢 | 第50-51页 |
| 参考文献 | 第51-55页 |
| 附录: 作者在攻读硕士学位期间发表的论文 | 第55-56页 |
| 作者申请学位论文或科研成果 | 第55页 |
| 作者其他论文或科研成果 | 第55-56页 |
| 附件 | 第56页 |
