S1P/S1P1信号通路在肥大心肌细胞缺血后适应中的作用及其机制

【摘要】：目的：分离培养原代乳鼠心肌细胞并诱导其肥大,以肥大的心肌细胞模拟建立缺血后适应模型,在此基础上添加药物干预检测S1P/S1P1信号通路在肥大心肌细胞缺血后适应中的作用。方法：分离培养原代乳鼠心肌细胞,并通过免疫荧光法对其纯度进行鉴定。用去甲肾上腺素(NE)诱导心肌细胞肥大,通过RT-PCR检测β-MHC和测量细胞表面积来验证心肌细胞肥大情况并确定NE最佳浓度。用三气培养箱缺氧、复氧模拟建立细胞缺血再灌注模型及缺血后适应模型,通过TUNEL法检测细胞形态学凋亡和AnnexinV-FITC/PI双染法检测心肌细胞凋亡率来确定模型的建立情况并以RT-PCR检测相关mRNA (S1P1)的表达。肥大心肌细胞在缺氧后适应基础上添加药物干预信号通路进行相关检测,根据添加药物分为5组：(1)空白组,(2)S1P组,(3)W-146+S1P组,(4) PD98059+S1P组,(5) LY-294002+S1P组。通过流式检测心肌细胞凋亡率、TUNEL法检测心肌细胞凋亡形态、Western-blot检测凋亡蛋白及相关信号通路蛋白(t-ERK1/2、p-ERK1/2、t-Ak、p-Akt)表达。结果：(1)心肌细胞存活率为97%,免疫荧光检测心肌细胞纯度达到98%以上,满足实验要求。(2)RT-PCR检测发现随着NE浓度升高,心肌细胞β-MHC表达明显升高(P0.05)；心肌细胞表面积测定发现细胞表面积随NE浓度依赖性升高(P0.05),但NE浓度3uM与5uM时,细胞表面积变化则无明显差异(P0.05),因此NE浓度选用3uM。(3)TUNEL法和AnnexinV-FITC/PI双染法检测发现缺血再灌注组和缺血后适应组的细胞凋亡率均明显高于空白组(P0.05),而缺血后适应组的凋亡率要明显低于缺血再灌注组(P0.05)。此结果证实缺血再灌注模型和缺血后适应模型建造成功。RT-PCR检测发现缺血后适应组S1P1的表达较空白组和缺血再灌注组明显升高(P0.05)。(4)添加药物后,流式及TUNEL法检测发现S1P组和LY-294002+S1P组凋亡率明显低于其他各组(P0.05),两者之间无明显差异(P0.05),其他各组之间无明显差异(P0.05)；Western-blot检测发现S1P组和LY-294002+S1P组凋亡蛋白表达明显低于其他组(P0.05),而p-ERK明显高于其他组(P0.05),其他各组之间凋亡蛋白及p-ERK表达无明显差异(P0.05)；各组之间p-Akt的表达无明显差异(P0.05)。结论：S1P对肥大心肌细胞缺血后适应有保护作用,可以降低心肌细胞凋亡蛋白的表达,减少心肌细胞凋亡,其作用的发挥与S1P1受体有关,是通过激活ERK1/2信号通路完成的。
【关键词】：1-磷酸鞘氨醇 信号通路 缺血再灌注 缺血后适应 心肌细胞 细胞凋亡
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R542.2