| 摘要 | 第1-5页 |
| abstract | 第5-7页 |
| 常用英文缩写词中英文对照表 | 第7-13页 |
| 1 前言 | 第13-22页 |
| ·研究背景、目的和意义 | 第13-14页 |
| ·丝状真菌表达系统的研究进展 | 第14-22页 |
| ·提高丝状真菌蛋白表达量的策略 | 第15-20页 |
| ·启动子的选择和优化 | 第16-17页 |
| ·基因拷贝数 | 第17页 |
| ·密码子优化 | 第17-18页 |
| ·融合蛋白表达策略 | 第18页 |
| ·蛋白酶缺陷株的筛选 | 第18-19页 |
| ·工程菌的稳定性 | 第19页 |
| ·发酵条件的优化 | 第19-20页 |
| ·丝状真菌分泌的蛋白质途径 | 第20页 |
| ·丝状真菌的转化方法 | 第20-22页 |
| 2 材料与方法 | 第22-42页 |
| ·材料 | 第22-24页 |
| ·菌株 | 第22页 |
| ·质粒 | 第22页 |
| ·工具酶 | 第22页 |
| ·分子生物学常用试剂 | 第22页 |
| ·培养基 | 第22-23页 |
| ·常用试剂的配制 | 第23-24页 |
| ·主要仪器和设备 | 第24页 |
| ·实验方法 | 第24-42页 |
| ·里氏木霉菌株的培养和保存 | 第24页 |
| ·里氏木霉基因组的提取 | 第24-25页 |
| ·基因的扩增及回收 | 第25-27页 |
| ·引物设计 | 第25-26页 |
| ·PCR扩增 | 第26-27页 |
| ·PCR产物的回收 | 第27页 |
| ·里氏木霉胞内表达载体的构建 | 第27-35页 |
| ·Tcbh1-pUC19质粒的构建 | 第27-32页 |
| ·Pcbh1-PT质粒的构建 | 第32页 |
| ·PHT-PPT质粒的构建 | 第32-34页 |
| ·PHT-PPT-eGFP里氏木霉表达质粒的构建 | 第34页 |
| ·PHT-PPT-Circulin B里氏木霉表达质粒的构建 | 第34-35页 |
| ·里氏木霉原生质体的制备和表达质粒转化 | 第35-37页 |
| ·里氏木霉菌丝的培养 | 第35-36页 |
| ·里氏木霉原生质体的制备 | 第36页 |
| ·里氏木霉原生质体的转化 | 第36页 |
| ·里氏木霉转化子的筛选 | 第36-37页 |
| ·含eGFP的里氏木霉阳性转化子的鉴定 | 第37-39页 |
| ·eGFP在荧光显微镜的检测 | 第37页 |
| ·eGFP基因的PCR鉴定 | 第37-38页 |
| ·里氏木霉胞内总蛋白（含eGFP）的提取 | 第38页 |
| ·eGFP的SDS-PAGE分析 | 第38-39页 |
| ·含Circulin B的里氏木霉阳性转化子的鉴定 | 第39-42页 |
| ·Circulin B基因的PCR鉴定 | 第39页 |
| ·Circulin B阳性转化子胞内蛋白提取 | 第39页 |
| ·Circulin B的Tricine-SDS-PAGE分析 | 第39-41页 |
| ·Circulin B阳性转化子的抑菌实验 | 第41-42页 |
| 3 结果与分析 | 第42-52页 |
| ·里氏木霉基因组DNA的提取 | 第42页 |
| ·表达载体各元件的克隆 | 第42-45页 |
| ·里氏木霉纤维二糖水解酶启动子的克隆 | 第42-43页 |
| ·里氏木霉纤维二糖水解酶终止子的克隆 | 第43页 |
| ·潮霉素基因表达框PHT的克隆 | 第43-44页 |
| ·eGFP的基因克隆 | 第44页 |
| ·Circulin B的基因克隆 | 第44-45页 |
| ·里氏木霉胞内表达载体的构建及eGFP、Circulin B的装载 | 第45-47页 |
| ·里氏木霉胞内表达载体的构建 | 第45页 |
| ·eGFP基因的装载 | 第45-46页 |
| ·Circulin B基因的装载 | 第46-47页 |
| ·里氏木霉原生质体的制备 | 第47-48页 |
| ·PHT-PPT-eGFP质粒转化里氏木霉原生质体及鉴定 | 第48-50页 |
| ·PHT-PPT-eGFP质粒转化的PCR鉴定 | 第48-49页 |
| ·eGFP的荧光显微观察 | 第49页 |
| ·eGFP的SDS—PAGE分析 | 第49-50页 |
| ·PHT-PPT-Circulin B质粒转化里氏木霉原生质体及筛选 | 第50-52页 |
| ·PHT-PPT-Circulin B质粒的转化及PCR鉴定 | 第50-51页 |
| ·Circulin B的Tricine-SDS-PAGE分析 | 第51页 |
| ·Circulin B的抑菌试验 | 第51-52页 |
| 4 讨论 | 第52-57页 |
| ·提高蛋白表达量所采用的策略 | 第52-54页 |
| ·里氏木霉表达宿主的选择 | 第52页 |
| ·强启动子的应用 | 第52-53页 |
| ·密码子优化 | 第53页 |
| ·提高同源重组几率 | 第53页 |
| ·发酵条件的优化 | 第53-54页 |
| ·里氏木霉胞内表达载体的构建 | 第54页 |
| ·里氏木霉原生质体的制备及转化条件的优化 | 第54-55页 |
| ·增强型绿色荧光蛋白的表达 | 第55页 |
| ·Circulin B的表达 | 第55-57页 |
| 全文总结 | 第57-58页 |
| 致谢 | 第58-59页 |
| 参考文献 | 第59-63页 |
| 附录A pUC19质粒图谱 | 第63-64页 |
| 附录B 里氏木霉胞内表达载体的构建 | 第64-65页 |
| 附录C 里氏木霉胞内表达载体启动子Pcbh I的测序结果 | 第65页 |
